El almidón es la principal forma de reserva de carbono en plantas superiores y constituye el polisacárido de mayor importancia en la dieta humana. Este polímero está formado por dos componentes mayoritarios: amilosa, que está compuesta predominantemente por cadenas lineales de glucosa con uniones α-1,4; y amilopectina, un α-1,4 glucano con ramificaciones en α-1,6. A través de la formación de los gránulos insolubles semicristalinos de almidón, las células logran mantener al mínimo el efecto osmótico que causaría esta gran cantidad de residuos de glucosa por separado. El complejo ordenamiento a nivel molecular de estas estructuras involucra a una gran cantidad de enzimas asociadas a la síntesis del almidón. Entre ellas encontramos las almidón sintasas (SS, EC 2.4.1.21) tanto solubles como unidas a gránulo, las enzimas ramificantes (BE, EC 2.4.1.18) involucradas en la generación de los enlaces α-1,6, y las enzimas deramificantes (DBE, EC 3.2.1.68) responsable de la escisión de ramificaciones ubicadas en posiciones no compatibles con la estructura altamente ordenada del gránulo. Si bien los mecanismos exactos de inicio de síntesis del gránulo no fueron dilucidados hasta el momento, se ha visto que la gran mayoría de plantas sintetizan más de un gránulo excepto el organismo eucariota fotosintético más pequeño conocido hasta la fecha, Ostreococcus tauri. Este alga unicelular posee un único gránulo de almidón situado en el único cloroplasto presente en la célula que, al momento de la división celular, se particiona de tal manera que dota de un gránulo a cada uno de sus descendientes. En esta tesis intentamos ampliar los conocimientos sobre los mecanismos moleculares que gobiernan el metabolismo del almidón en Ostreococcus tauri basándonos fundamentalmente en los procesos de síntesis y haciendo principal énfasis en sus aspectos bioquímicos, evolutivos y regulatorios.En una primera sección se presenta la completa caracterización de la enzima ramificante OsstaSBE. Los parámetros que caracterizan la cinética enzimática de OsttaSBE se encuentran dentro de lo esperado para ortólogos de plantas superiores. El modelo molecular propuesto a partir del modelado por homología no solo resulta de buena calidad de acuerdo a criterios aceptados por la comunidad científica, sino que también permitieron la exitosa identificación de los residuos más importantes para la catálisis. Posteriormente se logró corroborar esta información mediante la generación de proteínas recombinantes mutantes para cada uno de estos aminoácidos, las cuales, al no presentar actividad enzimática, demostraron la importancia de los mismos a nivel catalítico. Se detalla también el comportamiento de sus dos módulos de unión a carbohidratos presentes en la estructura de la proteína, frente a la presencia de distintos polisacáridos. Se determinó, mediante la generación de proteínas truncadas, la necesidad absoluta de la presencia de uno de estos módulos, siendo a su vez el primer reporte de un módulo de esta familia en una enzima ramificante.En una segunda sección se detalla la generación de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana sobreexpresando OsttaSBE. Estas líneas presentan una clara disminución en el tamaño de sus gránulos de almidón, demostrando la gran importancia de la enzima ramificante en su morfología. El aumento de los niveles de transcriptos de OsttaSBE trae aparejado un concomitante aumento de aquellos transcriptos que codifican para la almidón sintasa III endógena, en sintonía con la formación de complejos macromoleculares previamente reportados. Si bien nuestros ensayos de interacción no pudieron demostrar la interacción con la isoforma B de la almidón sintasa III de Ostreococcus, entendemos que en el alga esta asociación puede estar dándose tanto con la isoforma A como con la C, las cuales no hemos podido expresar en su forma entera hasta la fecha. Sumado al gránulo de menores proporciones se detectó un aumento generalizado de la degradación del almidón, consecuencia de un mecanismo de constante reestructuración de los gránulos que no llegan a desarrollar los tamaños observados en las líneas salvajes.En la última sección se presenta la caracterización de un polipéptido (OsttaAMILASA) cuya estructura modular presenta un dominio de unión a carbohidratos de la familia 20 y un dominio de hélice superenrollada que suele estar ligado a la interacción proteína-proteína. Los CBM20 están asociados a proteínas de degradación como por ejemplo amilasas, glucoamilasas y la proteína Laforina presente en Homo sapiens cuya función es similar a las fosfoglucano fosfatasas de plantas. Si bien no se pudo contar con la información proveniente de ortólogos en otros organismos, ya que los alineamientos de la secuencia completa de OsttaAMILASA no arrojaron resultados satisfactorios, sí se pudo hacer un análisis de los perfiles de expresión en el ritmo circadiano. Esta proteína no presenta perfiles de expresión típicos de enzimas degradativas como pudimos ver gracias al análisis de datos de RNA-Seq que se obtuvieron de mediciones llevadas a cabo a lo largo de día. OsttaAMILASA presenta una elevada afinidad por el almidón a través de su CBM, y también forma complejos macromoleculares con la almidón sintasa III B de Ostreococcus. Estos datos sugieren un mecanismo de asociación de las almidón sintasas al gránulo durante la síntesis, llevado a cabo por OsttaAMILASA.Fil: Hedin, Nicolas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentin
