En este trabajo se describe la puesta punto de la técnica de PCR para la determinación de distintos agentes infecciosos en pajuelas de semen bovino de Uruguay.Fil: Alzugaray, M. F.. Universidad de la República; UruguayFil: Susuki, K.. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias; ArgentinaFil: Acevedo, C.. Universidad de la República; UruguayFil: Satragno, D.. Universidad de la República; UruguayFil: González, G.. Universidad de la República; UruguayFil: Guarino, H.. Universidad de la República; UruguayFil: Bermudez, J.. Universidad de la República; UruguayFil: Echeverria, Maria Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico CONICET- La Plata. Instituto de Genética Veterinaria "Ing. Fernando Noel Dulout". Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Genética Veterinaria; Argentin

Acevedo, C.

Alzugaray, M. F.

Bermudez, J.

Echeverria, Maria Gabriela

González, G.

Guarino, H.

Satragno, D.

Susuki, K.

Analecta Veterinaria

CONICET Digital

Survey of diseases affecting reproduction in freeze bovine semen using the polymerase chain reaction (PCR)

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

Las enfermedades reproductivas son una de las principales causas de los bajos índices de procreo en Uruguay. El diagnóstico de estas enfermedades se lleva a cabo por diversas técnicas de laboratorio; la mayoría de las cuales no permiten la diferenciación de las distintas subespecies de cada microorganismo, hecho que si se puede determinar por medio de la técnica de PCR. En este estudio se intentó determinar la presencia de genomas de: Diarrea Viral Bovina, Herpesvirus bovino tipos 1 y 5, Campylobacter fetus fetus y fetus veneralis y Tritrichomonas foetus foetus. Para ello, 100 pajuelas de semen de bovinos de distintas razas fueron procesadas mediante PCR utilizando “primers” específicos para cada una de las enfermedades en estudio. Todas las muestras analizadas resultaron negativas a la detección de genomas de los agentes mencionados. Esta investigación permitió comprobar el buen nivel de los centros de reproducción evaluados, repercutiendo favorablemente en la sanidad del rodeo nacional. Así mismo, el chequeo de pajuelas de semen por medio de la técnica de PCR demostró ser una herramienta necesaria que debería ser utilizada de rutina ya que permite un rápido y eficiente diagnóstico.Reproductive diseases are a major cause of low calving rates nationwide. The diagnosis of these diseases is performed by various laboratory techniques, most of them do not allow differentiation in different subspecies of each organism, a fact that it can be determined by PCR. This study attempted to determine the presence of genome of bovine viral diarrhea, bovine herpesvirus types 1 and 5, Campylobacter fetus fetus and fetus veneralis and Tritrichomonas foetus foetus. One hundred bovine semen straws were collected and PCR technique using specific primers for each of the diseases studied were applied. All samples were negative for the detection of genomes of the pathogens mentioned. This investigation allowed to check the proper level of insemmination centers evaluated, impacting positively on the health of the national herd. Likewise, the screening of bovine semen straws by PCR proved to be a necessary tool that would be used routinously for quick and efficient diagnosis.Facultad de Ciencias Veterinaria

Suzuki, Kuniaki

Bermúdez, J.

Echeverría, María Gabriela

El Servicio de Difusión de la Creación Intelectual

Uruguay
RELEVAMIENTO POR REACCIÓN EN CADENA DE LA 
POLIMERASA (PCR) EN SEMEN CONGELADO DE 
ENFERMEDADES QUE AFECTAN LA REPRODUCCIÓN 
EN BOVINOS EN URUGUAY
Alzugaray MF1, Suzuki K2, Acevedo C1, Satragno D1, González G1, 
Guarino H1, Bermúdez J1, Echeverría MG3
1UDELAR, Departamento de Ciencias Microbiológicas - Instituto de Patobiología - Facultad de 
Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600, Montevideo, Uruguay.
2Experto JICA PROVETSUR, Universidad de la Plata- Facultad de Ciencias Veterinarias 
3Universidad Nacional de La Plata e Investigador del CONICET 
Cátedra de Virología- Facultad de Ciencias Veterinarias.
Resumen: Las enfermedades reproductivas son una de las principales causas de los bajos 
índices de procreo en Uruguay. El diagnóstico de estas enfermedades se lleva a cabo por 
diversas técnicas de laboratorio; la mayoría de las cuales no permiten la diferenciación de 
las distintas subespecies de cada microorganismo, hecho que si se puede determinar por 
medio de la técnica de PCR. En este estudio se intentó determinar la presencia de genomas 
de: Diarrea Viral Bovina, Herpesvirus bovino tipos 1 y 5, Campylobacter fetus fetus y fetus 
veneralis y Tritrichomonas foetus foetus. Para ello, 100 pajuelas de semen de bovinos de 
distintas razas fueron procesadas mediante PCR utilizando “primers” específicos para cada 
una de las enfermedades en estudio. Todas las muestras analizadas resultaron negativas a 
la detección de genomas de los agentes mencionados. Esta investigación permitió comprobar 
el buen nivel de los centros de reproducción evaluados, repercutiendo favorablemente en la 
sanidad del rodeo nacional. Así mismo, el chequeo de pajuelas de semen por medio de la 
técnica de PCR demostró ser una herramienta necesaria que debería ser utilizada de rutina 
ya que permite un rápido y eficiente diagnóstico.
Palabras Clave: bovino - diagnóstico - técnicas moleculares.
SURVEY OF DISEASES AFFECTING REPRODUCTION IN 
FREEZE BOVINE SEMEN USING THE 
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
ABSTRACT: Reproductive diseases are a major cause of low calving rates nationwide. The 
diagnosis of these diseases is performed by various laboratory techniques, most of them do 
not allow differentiation in different subspecies of each organism, a fact that it can be de- 
termined by PCR. This study attempted to determine the presence of genome of bovine viral 
diarrhea, bovine herpesvirus types 1 and 5, Campylobacter fetus fetus and fetus veneralis 
and Tritrichomonas foetus foetus. One hundred bovine semen straws were collected and PCR 
technique using specific primers for each of the diseases studied were applied. All samples 
were negative for the detection of genomes of the pathogens mentioned. This investigation 
allowed to check the proper level of insemmination centers evaluated, impacting positively on 
the health of the national herd. Likewise, the screening of bovine semen straws by PCR proved 
to be a necessary tool that would be used routinously for quick and efficient diagnosis.
Key Words: bovine - diagnostics - molecular techniques.
Dirección para correspondencia: MF Alzugaray UDELAR, Departamento de Ciencias Microbiológicas - Instituto de 
Patobiología - Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600, Montevideo, Uruguay.
E-mail:mafealga@adinet.com.uy
46 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 iSSn 0365-5148
JICA
INTRODUCCIÓN
Uno de los principales problemas a encarar 
en el control de las afecciones reproductivas del 
ganado bovino lo constituyen las enfermedades 
infecciosas transmitidas por el semen. Dentro de 
estas se incluyen varios agentes etiológicos des­
tacándose virus, bacterias y protozoarios. Entre 
las enfermedades virales de mayor prevalencia 
en el Uruguay se encuentran el virus de Diarrea 
viral bovina (DVB) y el Herpesvirus Bovino tipo 
1 (BoHV-1) (1, 2, 3). La DVB ocasiona aborto, 
reabsorción embrionaria, repetición de celo o 
infertilidad en hembras, terneros con defectos 
teratogénicos y machos persistentemente infecta­
dos (PI). Su agente etiológico pertenece a la familia 
Flaviviridae, y presenta desde el punto de vista 
de su comportamiento in vitro, cepas citopáticas 
como no citopáticas (4). El BoHV-1 infecta tanto 
el tracto respiratorio como el genital, causando 
diversos trastornos reproductivos. En terneros 
jóvenes puede causar encefalitis, aunque el 
agente causal de esta enfermedad está clasificado 
actualmente como Herpesvirus bovino 5 (BoHV- 
5) (5). Dentro de las principales enfermedades 
bacterianas, se encuentra la Campylobacteriosis 
genital bovina, que se caracteriza por ocasionar 
infertilidad, repetición de celo y abortos. El agente 
etiológico es Campylobacter fetus con 2 subespe­
cies: venerealis y fetus (6). La Tricomoniasis geni­
tal bovina produce repetición de celo, infertilidad, 
piómetra y aborto ocasional. Su agente causal es 
un protozoario flagelado llamado Tritrichomona 
foetus (7). La prevalencia de Campylobacteriosis 
en toros en Uruguay, determinada por Inmu- 
nofluorescencia de raspajes prepuciales, es del 
orden del 28%, mientras que la Tricomoniasis 
genital en estas últimas décadas no ha sido de­
tectada (5). Si bien estas enfermedades son de 
transmisión venérea, y aunque la proporción de 
establecimientos que utilizan la inseminación 
artificial es baja, su uso constituye un medio muy 
importante para su difusión. Las limitaciones del 
aislamiento de estos agentes infecciosos a partir 
del semen pueden ser superadas con el empleo de 
técnicas moleculares como la reacción en cadena 
de la polimerasa (PCR), que ha demostrado ser 
altamente sensible y específica en el estudio de 
genomas de diversos microorganismos (8, 9, 10). 
El objetivo de este estudio fue evaluar la condición 
sanitaria del semen bovino congelado de origen 
uruguayo que se comercializa en nuestro país 
por medio de la técnica de PCR.
MATERIALES Y MÉTODOS 
MUESTRAS Y SEPARACIÓN DE 
FRACCIONES SEMINALES:
Se analizaron 100 pajuelas de semen de 
distintas partidas, pertenecientes a 35 toros na­
cionales de razas predominantes a nivel nacional 
(63 Holando, 22 Hereford, 9 Aberdeen Angus, 3 
Limousin y 3 Brangus) de distintos centros de 
reproducción del país, concentrados en 5 estable­
cimientos que congelan semen. El fluido seminal 
se separó en tres partes mediante centrifugación 
(7000 g 10 min): 500 gl de plasma para la obten­
ción de ARN, 500 gl de plasma para la obtención 
de ADN y el pellet celular para extracción de ADN 
de células totales.
EXTRACCIÓN DE ARN PARA DVB:
El ARN total fue obtenido mediante el reac­
tivo de TRIzol® (Invitrogen). Para ello, 500 gl de 
plasma seminal se mezclaron y agitaron durante 
10 min con 500 gl de TRIzol® y 220 gl de clorofor­
mo. Posteriormente a ser centrifugado a 12000 g 
por 10 min, la fase acuosa superior (650 gl) fue 
precipitada con 750 gl de isopropanol a -20° C, se 
centrifugó a 12000 g por 10 min, se secó a 37 °C 
por 10 min y se resuspendió con agua libre de 
nucleasas (40 gl).
TRANSCRIPCIÓN REVERSA:
Para el primer paso de síntesis de ADN 
copia se incubaron 5 min a 70°C, 5 gl de ARN, 
1 gl de Random Primers® (Biodynamics) y 9 gl 
de agua libre de nucleasas. Luego se realizó la 
segunda etapa, agregándose a la mezcla anterior 
5 gl Buffer MMLV (Promega), 1gl de dNTPs, 1 gl 
RNasin (Promega), 1 gl MMLV transcriptasa re­
versa (Promega) y 2 gl de agua libre de nucleasas 
(total 25 gl), incubándose a 37 °C una hora para 
permitir la síntesis del ADN copia.
EXTRACCIÓN DE ADN:
Se realizó la extracción de ADN de plasma 
seminal para BoHV siguiendo el protocolo de 
extracción destinado a sangre entera de Wizard® 
Genomic DNA Purification Kit, mientras que para 
Campylobacter fetus y Tritrichomona foetus foetus 
se utilizó el pellet seminal siguiendo el protocolo 
para bacterias Gram negativas del kit anterior­
mente citado.
PRIMERS:
Para DVB las secuencias fueron: 324F 
5'ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA3' y 326R 5' 
TCAACTCCATGTGCCATGTAC 3' (GenBank FM 
161986) produciendo un producto de PCR de 
252 pb. Para el caso de BoHV se utilizaron dos 
pares de cebadores que amplifican una porción 
genómica de 183 pb del gen TK de BoHV-1 y de 
564 pb del gen de la gD del BoHV-5 [11]. Se utili­
zaron cebadores específicos para Campylobacter 
fetus fetus (producto de 960 pb) y Campylobacter 
fetus venerealis (producto de 142 pb) de acuerdo 
con Hum y col. (9). Para el caso de Tritrichomona 
iSSn 0365-5148 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 47
Uruguay
foetus foetus las secuencias utilizadas fueron 
las utilizadas por Felleisen y col. (10) dando un 
producto de 347 pb.
REACCIÓN EN CADENA DE LA 
POLIMERASA (PCR):
Todas las reacciones se realizaron en un 
volumen final de 25 gl de los cuales la mitad 
consistió en 2xPCR Master Mix (Promega) y 1 gl 
de cada molde, ADN o ARN. De acuerdo a la 
concentración de los primers utilizada, se varió 
el volumen de agua libre de nucleasas. Para DVB 
se adicionaron 0,125 gl de cada primer y las 
condiciones de ciclado consistieron en 35 ciclos 
de 94 °C por 30 seg, 55 °C por 30 seg y 72 °C 
por 1 min. Para el caso de BoHV-1 la mezcla de 
reacción contuvo 0,25 gl de cada primer, mientras 
que para BoHV-5 se utilizó 1 gl de cada primer. 
Las condiciones de ciclado fueron 35 ciclos de 
95 °C por 1 min, 56 °C por 1 min y 72 °C por 1 
min. Para Campylobacter fetus fetus se utilizaron 
0,25 gl de cada primer y para Campylobacter 
fetus venerealis 0,125 gl. El ciclado fue común 
a ambas subespecies de 35 ciclos de 95 °C por 
30 seg, 50 °C por 30 seg y 72 °C por 2 min. Para 
Tritrichomona foetus foetus se utilizaron 0,125 gl 
de cada primer y las condiciones de ciclado fueron 
35 ciclos de 95 °C por 30 seg, 60 °C por 30 seg y 
72 °C por 1 min. En todos los casos, se realizó un 
ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C 10 min 
y un ciclo final de extensión a 72 °C 5 min en un 
termociclador Corbett Research, Modelo Palm- 
Cycler®. Los productos de amplificación (8 pl) 
fueron sembrados en geles de agarosa con buffer 
TBE 0,5 x (0,045 M Tris-borato y 0,001M EDTA 
[pH 8]), al 1,5, 2 o 2,5 % de acuerdo al tamaño 
de producto esperado y fueron visualizados en 
transiluminador con luz ultravioleta después 
de ser teñidos por 10 minutos en 0,5 gg/ml de 
bromuro de etidio. Para validar cada una de las 
PCR, se utilizaron cepas controles.
RESULTADOS
Todas las muestras recibidas y analiza­
das resultaron negativas para la detección de 
los agentes estudiados. En todos los casos se 
obtuvieron resultados positivos con las cepas 
controles, lo cual valida las técnicas realizadas 
(Figura 1).
DISCUSIÓN
Los diagnósticos realizados no arrojaron 
resultados positivos para los agentes estudia­
dos. Sin embargo, estudios llevados a cabo en 
Uruguay por Guarino y col. (12) detectaron sobre 
un total de 204 muestras de semen congelado, 4 
C. f. fetus T. foetus DVB
BoHV-1 C. f. venerealis
Figura 1: Amplificación por PCR para C. f. fetus, T. foetus, DVB, BoHV-1 y C. f. 
venearealis. Filas 1 a 4: muestras de semen (todas negativas); L: Marcador de 100 
pb; Filas C: control positivo para cada uno de los agentes mencionados (aproxi­
madamente 960, 347, 252, 183 y 142 pb respectivamente)
Figure 1: PCR amplification of C. f. fetus, T. foetus, DVB, BoHV-1 y C. f. Venearea- 
lis genomes. Files 1-4: negative semen samples; L: 100 bp ladder; File C: positive 
control of each pathogen (960, 347, 252, 183 and 142 bp respectively)
48 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 iSSn 0365-5148
JICA
muestras positivas a DVB (1,9 %), 11 a BoHV-1 
(5,3 %) y 11 a Campylobacter fetus fetus (5,3 %). 
Como hemos mencionado anteriormente, la pre­
sencia de BoHV constituye un riesgo ya que el 
animal portador de virus latente puede excretar el 
mismo luego de un periodo de inmunosupresión. 
Consideramos que este hecho fue subsanado al 
obtener varias muestras del mismo animal con 
intervalos de tiempo cortos. Por medio de la téc­
nica de PCR es posible evaluar diferentes partidas 
de semen y así asegurar el uso de aquellas libre 
de virus detectando al portador. En el caso de 
DVB, se puede detectar el virus en animales PI, no 
identificables serológicamente. Con esta técnica 
se logra la detección en forma sencilla y prema­
tura del virus. Para el caso de Campylobacter y 
Tritrichomona, la mayor ventaja de la PCR es que 
detecta al agente en partidas de semen congela­
das donde no se dispone del toro para realizar 
raspajes prepuciales. Es importante destacar que 
en el caso de nuestro estudio los centros que cola­
boraron son de reconocida trayectoria nacional y 
demostraron eficiencia al momento de enviar las 
muestras en condiciones adecuadas, así como en 
el trabajo diario con los animales. Asimismo, las 
razas procesadas son de importancia ya que se 
trata de las razas más representativas en nuestro 
país, permitiendo evaluar la calidad de semen 
que es comercializada tanto a establecimientos 
de leche como de carne, a pesar que solo 6 % de 
los establecimientos uruguayos utilizan insemi­
nación artificial (5).
Se logró demostrar que el análisis de se­
men por la técnica de PCR es rápido y sensible, 
permitiendo certificar la condición de libre de los 
principales agentes infecciosos, y de esta manera 
se puede controlar la diseminación de los mismos 
en el rodeo. El uso de semen sin chequeo previo 
trae aparejado un importante riesgo de fracaso en 
el intento de mejoramiento genético uruguayo.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio contó con el apoyo económico 
de JICA (Agencia Internacional de Cooperación 
del Japón). Un especial agradecimiento a Dr. 
Alejandro Valera por la lectura crítica del ma­
nuscrito.
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Uruguayas de Buiatría. Paysandú 2004; 10-12 junio, 
pág. 214- 216.
iSSn 0365-5148 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 49


Spanish

UruguayRELEVAMIENTO POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN SEMEN CONGELADO DE ENFERMEDADES QUE AFECTAN LA REPRODUCCIÓN EN BOVINOS EN URUGUAYAlzugaray MF1, Suzuki K2, Acevedo C1, Satragno D1, González G1, Guarino H1, Bermúdez J1, Echeverría MG31UDELAR, Departamento de Ciencias Microbiológicas - Instituto de Patobiología - Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600, Montevideo, Uruguay.2Experto JICA PROVETSUR, Universidad de la Plata- Facultad de Ciencias Veterinarias 3Universidad Nacional de La Plata e Investigador del CONICET Cátedra de Virología- Facultad de Ciencias Veterinarias.Resumen: Las enfermedades reproductivas son una de las principales causas de los bajos índices de procreo en Uruguay. El diagnóstico de estas enfermedades se lleva a cabo por diversas técnicas de laboratorio; la mayoría de las cuales no permiten la diferenciación de las distintas subespecies de cada microorganismo, hecho que si se puede determinar por medio de la técnica de PCR. En este estudio se intentó determinar la presencia de genomas de: Diarrea Viral Bovina, Herpesvirus bovino tipos 1 y 5, Campylobacter fetus fetus y fetus veneralis y Tritrichomonas foetus foetus. Para ello, 100 pajuelas de semen de bovinos de distintas razas fueron procesadas mediante PCR utilizando “primers” específicos para cada una de las enfermedades en estudio. Todas las muestras analizadas resultaron negativas a la detección de genomas de los agentes mencionados. Esta investigación permitió comprobar el buen nivel de los centros de reproducción evaluados, repercutiendo favorablemente en la sanidad del rodeo nacional. Así mismo, el chequeo de pajuelas de semen por medio de la técnica de PCR demostró ser una herramienta necesaria que debería ser utilizada de rutina ya que permite un rápido y eficiente diagnóstico.Palabras Clave: bovino - diagnóstico - técnicas moleculares.SURVEY OF DISEASES AFFECTING REPRODUCTION IN FREEZE BOVINE SEMEN USING THE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)ABSTRACT: Reproductive diseases are a major cause of low calving rates nationwide. The diagnosis of these diseases is performed by various laboratory techniques, most of them do not allow differentiation in different subspecies of each organism, a fact that it can be de- termined by PCR. This study attempted to determine the presence of genome of bovine viral diarrhea, bovine herpesvirus types 1 and 5, Campylobacter fetus fetus and fetus veneralis and Tritrichomonas foetus foetus. One hundred bovine semen straws were collected and PCR technique using specific primers for each of the diseases studied were applied. All samples were negative for the detection of genomes of the pathogens mentioned. This investigation allowed to check the proper level of insemmination centers evaluated, impacting positively on the health of the national herd. Likewise, the screening of bovine semen straws by PCR proved to be a necessary tool that would be used routinously for quick and efficient diagnosis.Key Words: bovine - diagnostics - molecular techniques.Dirección para correspondencia: MF Alzugaray UDELAR, Departamento de Ciencias Microbiológicas - Instituto de Patobiología - Facultad de Veterinaria, Lasplaces 1550 C.P. 11600, Montevideo, Uruguay.E-mail:mafealga@adinet.com.uy46 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 iSSn 0365-5148JICAINTRODUCCIÓNUno de los principales problemas a encarar en el control de las afecciones reproductivas del ganado bovino lo constituyen las enfermedades infecciosas transmitidas por el semen. Dentro de estas se incluyen varios agentes etiológicos des­tacándose virus, bacterias y protozoarios. Entre las enfermedades virales de mayor prevalencia en el Uruguay se encuentran el virus de Diarrea viral bovina (DVB) y el Herpesvirus Bovino tipo 1 (BoHV-1) (1, 2, 3). La DVB ocasiona aborto, reabsorción embrionaria, repetición de celo o infertilidad en hembras, terneros con defectos teratogénicos y machos persistentemente infecta­dos (PI). Su agente etiológico pertenece a la familia Flaviviridae, y presenta desde el punto de vista de su comportamiento in vitro, cepas citopáticas como no citopáticas (4). El BoHV-1 infecta tanto el tracto respiratorio como el genital, causando diversos trastornos reproductivos. En terneros jóvenes puede causar encefalitis, aunque el agente causal de esta enfermedad está clasificado actualmente como Herpesvirus bovino 5 (BoHV- 5) (5). Dentro de las principales enfermedades bacterianas, se encuentra la Campylobacteriosis genital bovina, que se caracteriza por ocasionar infertilidad, repetición de celo y abortos. El agente etiológico es Campylobacter fetus con 2 subespe­cies: venerealis y fetus (6). La Tricomoniasis geni­tal bovina produce repetición de celo, infertilidad, piómetra y aborto ocasional. Su agente causal es un protozoario flagelado llamado Tritrichomona foetus (7). La prevalencia de Campylobacteriosis en toros en Uruguay, determinada por Inmu- nofluorescencia de raspajes prepuciales, es del orden del 28%, mientras que la Tricomoniasis genital en estas últimas décadas no ha sido de­tectada (5). Si bien estas enfermedades son de transmisión venérea, y aunque la proporción de establecimientos que utilizan la inseminación artificial es baja, su uso constituye un medio muy importante para su difusión. Las limitaciones del aislamiento de estos agentes infecciosos a partir del semen pueden ser superadas con el empleo de técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha demostrado ser altamente sensible y específica en el estudio de genomas de diversos microorganismos (8, 9, 10). El objetivo de este estudio fue evaluar la condición sanitaria del semen bovino congelado de origen uruguayo que se comercializa en nuestro país por medio de la técnica de PCR.MATERIALES Y MÉTODOS MUESTRAS Y SEPARACIÓN DE FRACCIONES SEMINALES:Se analizaron 100 pajuelas de semen de distintas partidas, pertenecientes a 35 toros na­cionales de razas predominantes a nivel nacional (63 Holando, 22 Hereford, 9 Aberdeen Angus, 3 Limousin y 3 Brangus) de distintos centros de reproducción del país, concentrados en 5 estable­cimientos que congelan semen. El fluido seminal se separó en tres partes mediante centrifugación (7000 g 10 min): 500 gl de plasma para la obten­ción de ARN, 500 gl de plasma para la obtención de ADN y el pellet celular para extracción de ADN de células totales.EXTRACCIÓN DE ARN PARA DVB:El ARN total fue obtenido mediante el reac­tivo de TRIzol® (Invitrogen). Para ello, 500 gl de plasma seminal se mezclaron y agitaron durante 10 min con 500 gl de TRIzol® y 220 gl de clorofor­mo. Posteriormente a ser centrifugado a 12000 g por 10 min, la fase acuosa superior (650 gl) fue precipitada con 750 gl de isopropanol a -20° C, se centrifugó a 12000 g por 10 min, se secó a 37 °C por 10 min y se resuspendió con agua libre de nucleasas (40 gl).TRANSCRIPCIÓN REVERSA:Para el primer paso de síntesis de ADN copia se incubaron 5 min a 70°C, 5 gl de ARN, 1 gl de Random Primers® (Biodynamics) y 9 gl de agua libre de nucleasas. Luego se realizó la segunda etapa, agregándose a la mezcla anterior 5 gl Buffer MMLV (Promega), 1gl de dNTPs, 1 gl RNasin (Promega), 1 gl MMLV transcriptasa re­versa (Promega) y 2 gl de agua libre de nucleasas (total 25 gl), incubándose a 37 °C una hora para permitir la síntesis del ADN copia.EXTRACCIÓN DE ADN:Se realizó la extracción de ADN de plasma seminal para BoHV siguiendo el protocolo de extracción destinado a sangre entera de Wizard® Genomic DNA Purification Kit, mientras que para Campylobacter fetus y Tritrichomona foetus foetus se utilizó el pellet seminal siguiendo el protocolo para bacterias Gram negativas del kit anterior­mente citado.PRIMERS:Para DVB las secuencias fueron: 324F 5'ATGCCCTTAGTAGGACTAGCA3' y 326R 5' TCAACTCCATGTGCCATGTAC 3' (GenBank FM 161986) produciendo un producto de PCR de 252 pb. Para el caso de BoHV se utilizaron dos pares de cebadores que amplifican una porción genómica de 183 pb del gen TK de BoHV-1 y de 564 pb del gen de la gD del BoHV-5 [11]. Se utili­zaron cebadores específicos para Campylobacter fetus fetus (producto de 960 pb) y Campylobacter fetus venerealis (producto de 142 pb) de acuerdo con Hum y col. (9). Para el caso de Tritrichomona iSSn 0365-5148 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 47Uruguayfoetus foetus las secuencias utilizadas fueron las utilizadas por Felleisen y col. (10) dando un producto de 347 pb.REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):Todas las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 gl de los cuales la mitad consistió en 2xPCR Master Mix (Promega) y 1 gl de cada molde, ADN o ARN. De acuerdo a la concentración de los primers utilizada, se varió el volumen de agua libre de nucleasas. Para DVB se adicionaron 0,125 gl de cada primer y las condiciones de ciclado consistieron en 35 ciclos de 94 °C por 30 seg, 55 °C por 30 seg y 72 °C por 1 min. Para el caso de BoHV-1 la mezcla de reacción contuvo 0,25 gl de cada primer, mientras que para BoHV-5 se utilizó 1 gl de cada primer. Las condiciones de ciclado fueron 35 ciclos de 95 °C por 1 min, 56 °C por 1 min y 72 °C por 1 min. Para Campylobacter fetus fetus se utilizaron 0,25 gl de cada primer y para Campylobacter fetus venerealis 0,125 gl. El ciclado fue común a ambas subespecies de 35 ciclos de 95 °C por 30 seg, 50 °C por 30 seg y 72 °C por 2 min. Para Tritrichomona foetus foetus se utilizaron 0,125 gl de cada primer y las condiciones de ciclado fueron 35 ciclos de 95 °C por 30 seg, 60 °C por 30 seg y 72 °C por 1 min. En todos los casos, se realizó un ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C 10 min y un ciclo final de extensión a 72 °C 5 min en un termociclador Corbett Research, Modelo Palm- Cycler®. Los productos de amplificación (8 pl) fueron sembrados en geles de agarosa con buffer TBE 0,5 x (0,045 M Tris-borato y 0,001M EDTA [pH 8]), al 1,5, 2 o 2,5 % de acuerdo al tamaño de producto esperado y fueron visualizados en transiluminador con luz ultravioleta después de ser teñidos por 10 minutos en 0,5 gg/ml de bromuro de etidio. Para validar cada una de las PCR, se utilizaron cepas controles.RESULTADOSTodas las muestras recibidas y analiza­das resultaron negativas para la detección de los agentes estudiados. En todos los casos se obtuvieron resultados positivos con las cepas controles, lo cual valida las técnicas realizadas (Figura 1).DISCUSIÓNLos diagnósticos realizados no arrojaron resultados positivos para los agentes estudia­dos. Sin embargo, estudios llevados a cabo en Uruguay por Guarino y col. (12) detectaron sobre un total de 204 muestras de semen congelado, 4 C. f. fetus T. foetus DVBBoHV-1 C. f. venerealisFigura 1: Amplificación por PCR para C. f. fetus, T. foetus, DVB, BoHV-1 y C. f. venearealis. Filas 1 a 4: muestras de semen (todas negativas); L: Marcador de 100 pb; Filas C: control positivo para cada uno de los agentes mencionados (aproxi­madamente 960, 347, 252, 183 y 142 pb respectivamente)Figure 1: PCR amplification of C. f. fetus, T. foetus, DVB, BoHV-1 y C. f. Venearea- lis genomes. Files 1-4: negative semen samples; L: 100 bp ladder; File C: positive control of each pathogen (960, 347, 252, 183 and 142 bp respectively)48 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 iSSn 0365-5148JICAmuestras positivas a DVB (1,9 %), 11 a BoHV-1 (5,3 %) y 11 a Campylobacter fetus fetus (5,3 %). Como hemos mencionado anteriormente, la pre­sencia de BoHV constituye un riesgo ya que el animal portador de virus latente puede excretar el mismo luego de un periodo de inmunosupresión. Consideramos que este hecho fue subsanado al obtener varias muestras del mismo animal con intervalos de tiempo cortos. Por medio de la téc­nica de PCR es posible evaluar diferentes partidas de semen y así asegurar el uso de aquellas libre de virus detectando al portador. En el caso de DVB, se puede detectar el virus en animales PI, no identificables serológicamente. Con esta técnica se logra la detección en forma sencilla y prema­tura del virus. Para el caso de Campylobacter y Tritrichomona, la mayor ventaja de la PCR es que detecta al agente en partidas de semen congela­das donde no se dispone del toro para realizar raspajes prepuciales. Es importante destacar que en el caso de nuestro estudio los centros que cola­boraron son de reconocida trayectoria nacional y demostraron eficiencia al momento de enviar las muestras en condiciones adecuadas, así como en el trabajo diario con los animales. Asimismo, las razas procesadas son de importancia ya que se trata de las razas más representativas en nuestro país, permitiendo evaluar la calidad de semen que es comercializada tanto a establecimientos de leche como de carne, a pesar que solo 6 % de los establecimientos uruguayos utilizan insemi­nación artificial (5).Se logró demostrar que el análisis de se­men por la técnica de PCR es rápido y sensible, permitiendo certificar la condición de libre de los principales agentes infecciosos, y de esta manera se puede controlar la diseminación de los mismos en el rodeo. El uso de semen sin chequeo previo trae aparejado un importante riesgo de fracaso en el intento de mejoramiento genético uruguayo.AGRADECIMIENTOSEste estudio contó con el apoyo económico de JICA (Agencia Internacional de Cooperación del Japón). Un especial agradecimiento a Dr. Alejandro Valera por la lectura crítica del ma­nuscrito.BIBLIOGRAFÍA1. Mederos A, Hirigoyen D. Relevamiento epidemioló­gico de Diarrea Viral Bovina, Rinotraqueítis Infecciosa Bovina y Leucosis bovina en predios lecheros del nores­te de Uruguay. XXVI Jornadas Uruguayas de Buiatría. Paysandú, 1998; 18- 29 junio, pág. 19-20.2. Saizar J. Estudio serológico de la Diarrea Viral Bovina en bovinos del Uruguay. Veterinaria 1998; 34: 9-14.3. Saizar J. Determinación de la prevalencia de la Rinotraqueítis Infecciosa bovina en rodeos de leche y carne en Uruguay. Veterinaria 1997; 33: 3-6.4. Brownlie J, Clarke MC, Howard CJ. Pathogenesis and epidemiology of bovine virus diarrhoea viruses infection of cattle. Ann Resh Vet 1987; 18: 157-166.5. Repiso M, Gil A, Bañales P, D'Anatro N, Fernández L, Guarino H, Herrera B, Núñez A, Silva M, Olivera M, Osawa T, Silva M. Prevalencia de las principales en­fermedades infecciosas que afectan el comportamiento reproductivo en la ganadería de carne y caracteriza­ción de los establecimientos de cría del Uruguay. INIA 2001; 13: 1- 43.6. Berg RL, Jutila JW, Firehammer BD. A revised classification of Vibrio fetus. Am J Vet Res (1971). 32: 11-22.7. Anderson M. Diagnóstico de causas infecciosas en aborto bovino. XXXII Jornadas Uruguayas de Buiatría. Paysandú 2004; 10-12 junio, pág. 159-163.8. Rocha M, Barboza E, Guimaraes S, Dias Neto E, Gouveia A. A high sensitivity Nested PCR assay for BHV-1 detection in semen of naturally infected bulls. Vet Microbiol 1998; 63:1-11.9. Hum S, Quinn K, Brunner J, On SL. Evaluation of a PCR assay for identification and differentiation of Campylobacter fetus subspecies. Aust Vet J 1997; 75: 827- 831.10. Felleisen RS, Lambelet N, Bachmann P, Nicolet J, Muller N, Gottstein B. Detection of Tritrichomonas foetus by PCR and DNA enzyme inmunoassay based on rRNA gene unit sequences. J. Clin Microbiol 1998; 36: 513-519.11. Alegre M, Nanni M, Fondevila N. Development of a Multiplex Polymerase Chain Reaction for the Diffe- rentiation of Bovine Herpesvirus-1 and 5. J Vet Med B 2001; 48: 613- 621.12. Guarino H, D'Anatro N, Bañales P, Fernández L, González G, Bailón M. Control de la calidad sanitaria y biológica del semen bovino congelado. XXXII Jornadas Uruguayas de Buiatría. Paysandú 2004; 10-12 junio, pág. 214- 216.iSSn 0365-5148 An Ale c tA ve te r in A r iA 2010; 30 (Su p): 46-49 49

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Survey of diseases affecting reproduction in freeze bovine semen using the polymerase chain reaction (PCR)

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