La angiogénesis en condiciones fisiológicas es infrecuente en el adulto a excepción del tracto reproductor femenino. Los folículos ováricos preantrales no poseen vasculatura propia, la cual es adquirida durante el desarrollo del antro (1). La adquisición de un adecuado aporte sanguíneo es posiblemente un paso limitante en la selección y maduración del folículo dominante (1). La degeneración del lecho capilar en folículos que no lograron desarrollarse es un factor relevante causante de atresia (2). El folículo ovárico y el cuerpo lúteo producen el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGFA o VEGF) el cual juega un rol primordial en la angiogénesis ováricaFil: Abramovich, Dalhia Nurit. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Parborell, Maria Fernanda Agustina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Tesone, Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentin

Abramovich, Dalhia Nurit

Parborell, Maria Fernanda Agustina

Tesone, Marta

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Estudio de la foliculogénesis y apoptosis ovárica luego de la administración intraovárica de un inhibidor de VEGF (R1/Fc Chimera)

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

33Estudio de la foliculogénesis y apoptosisovárica luego de la administraciónintraovárica de un inhibidor de VEGF(R1/Fc Chimera)Dalhia Abramovich1; Fernanda Parborell1; Marta Tesone1,21Instituto de Biología y Medicina Experimental (IByME) – CONICET, 2Departamento de QuímicaBiológica, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, ArgentinaIntroducciónLa angiogénesis en condiciones fisioló-gicas es infrecuente en el adulto a excep-ción del tracto reproductor femenino. Losfolículos ováricos preantrales no poseenvasculatura propia, la cual es adquiridadurante el desarrollo del antro (1). Laadquisición de un adecuado aporte san-guíneo es posiblemente un paso limitan-te en la selección y maduración del folí-culo dominante (1). La degeneración dellecho capilar en folículos que no logra-ron desarrollarse es un factor relevantecausante de atresia (2). El folículo ováricoy el cuerpo lúteo producen el factor decrecimiento del endotelio vascular(VEGFA o VEGF) el cual juega un rol pri-mordial en la angiogénesis ovárica (3). La administración de un anticuerpocontra el receptor 2 de VEGF (Flk-1/KDR oVEGFR2) inhibe la angiogénesis foliculardependiente de gonadotropinas en ratónlo cual a su vez, bloquea el desarrollo foli-cular (4). Además, se ha observado que lainyección de VEGF en ovario de ratón pro-mueve el desarrollo folicular (5). Por otraparte, la inhibición de VEGF con un anta-gonista denominado Trap, produce unadisminución en la angiogénesis folicular yen la expresión de los receptores 1 y 2 deVEGF (VEGFR1 o Flt-1 y VEGFR2) en pri-mates no humanos (6). La inyección intra-folicular de un antagonista de VEGF en elmono rhesus impide la ovulación y el sub-siguiente desarrollo del cuerpo lúteo (7).Sin embargo, poco se sabe del rol deVEGF en la angiogénesis ovárica y laapoptosis. Particularmente, la relaciónque existe entre ambos procesos es pococonocida. Se ha reportado la existenciade VEGF y de sus receptores en célulasde granulosa y en células tecales tanto anivel de RNA mensajero como de proteí-na (8). Nosotros sugerimos que la apopto-sis en células de granulosa de los folícu-los seleccionados para la ovulaciónpodría prevenirse a través de las accionesautocrinas o paracrinas del VEGF.VEGF es citoprotector en células endo-teliales previniendo la apoptosis. Sinembargo, el rol de este factor en otros teji-dos aún no está claro. Algunos trabajoshan demostrado que el VEGF es citopro-tector en miocitos luego de injuria porisquemia (9) y que este factor ejerce unefecto directo de inhibición de la apopto-sis en neuronas y estimulación de neuro-génesis (10,11). Recientemente, Greenawayet al (12) ha demostrado que VEGF poseeun efecto citoprotector en células de gra-nulosa bovinas por inhibición de la apop-tosis y que este efecto estaría mediado porel receptor VEGFR2. El objetivo de este trabajo fue estudiarsi el VEGF intraovárico juega un papel crí-tico en la supervivencia celular necesariaTrabajo Originalpara el desarrollo folicular dependiente degonadotropinas. En particular, hemos exa-minado el efecto de la administración localde un antagonista de VEGF en el desarrollofolicular, la apoptosis y la expresión deproteínas de la familia de BCL2 (BAX,BCL2 y BCLX), FAS y FASL en folículosováricos de ratas prepúberes tratadas congonadotropina coriónica equina (eCG). Materiales y Métodos Ratas Sprague-Dawley prepúberes de21-23 días tratadas con eCG fueron inyec-tadas con un inhibidor de VEGF (Trap:quimera receptor 1 o Flt-1/Fc recombinan-te) intrabursa en un ovario. El ovario con-tralateral fue inyectado con vehículo paraser utilizado como control. Las dosis deTrap ensayadas fueron de 0.1 o 0.5 mg. Losovarios fueron extraídos 12, 24 o 48 horasluego de la inyección y procesados paracortes histológicos. Se realizó un recuentode folículos a los diferentes tiempos ensa-yados sobre cortes histológicos teñidoscon hematoxilina-eosina. Los folículosfueron clasificados como preantrales (PF),antrales tempranos (EAF), periovulatorios(POF: folículos preovulatorios y cuerposlúteos recién formados) y atrésicos (AtF).Con la dosis de 0.1 mg no se observarondiferencias significativas a ninguno de lostiempos ensayados y tampoco con la dosisde 0.5 mg a las 12 o 24 horas. Por lo tantolos siguientes ensayos se realizaron conuna dosis de 0.5 mg, 48 horas luego de lainyección. Se realizó la técnica de TUNELsobre cortes histológicos para detectarcélulas apoptóticas.Por otra parte, se aislaron folículosantrales sanos bajo la lupa (300-450 mmde diámetro) provenientes de ovarioscontroles y tratados con Trap. Se extraje-ron las proteínas de dichos folículos pararealizar la técnica de Western blot para ladetección de proteínas relacionadas conla apoptosis (BAX; BCL2; BCLXs,BCLXL, FAS y FASL).Para detectar diferencias en la permea-bilidad vascular entre ambos ovarios, serealizó la técnica de azul de Evans (EB)(13). Las ratas fueron anestesiadas e inyec-34tadas con 0.2 ml de una solución 5 mMen agua destilada de azul de Evans. Luegode 30 minutos, fueron sacrificadas. Losovarios fueron extraídos e incubados 24horas a 37º C en formamida. La absorban-cia del colorante en formamida fue leídaen un espectrofotómetro a 620 nm. ResultadosLa figura 1 muestra el efecto del Trapsobre la curva de tiempo para el creci-miento folicular.  La inyección de 0.5 mgde Trap/ovario no modificó el número dePF ni de EAF (Fig 1B, a y b); sin embargo,disminuyó significativamente el númerode folículos periovulatorios (Fig. 1B, c)(Control: 14.08 ± 1.49%; Trap: 8.54 ±1.72%, p<0.01, n=6) y produjo un aumen-to significativo en el número de folículosatrésicos (Fig 1B, d)  (Control: 10.46 ±0.54%; Trap: 16.38 ± 1.27%, p<0.05, n=6),48 horas luego de la inyección. No seobservaron diferencias significativas enningún estadio folicular a las 12 o 24 horasluego de la inyección ni con la dosis de0.1mg de Trap (datos no mostrados). Los cortes histológicos muestran ade-más que el tratamiento con Trap produjouna disminución en la densidad de lascélulas estromales con un incremento enel espacio extracelular.Como las células de granulosa muerenpor apoptosis durante el proceso de atre-sia folicular (14,15), se realizó la técnica deTUNEL sobre cortes histológicos. La figu-ra 2A muestra campos representativos deun ovario control y un ovario tratado. Eltratamiento con Trap produjo un aumen-to significativo en el número de célulasapoptóticas en EAF (Control: 3.17 ± 0.81células apoptóticas/campo; Trap: 6.81 ±1.02 células apoptóticas/campo, p<0.05,n=5) (Figura 2 B). Se realizó la técnica de azul de Evanspara medir la permeabilidad capilar en losavarios control y tratado con Trap. El con-tenido del colorante en el ovario tratadono fue significativamente diferente al delovario control (Control: 32.54 ± 1.98 ngEB/mg ovario, Trap: 31.92 ± 1.89 ngEB/mg ovario; p>0.05; n=14).35Trabajo OriginalFigura 1: Efecto de la inhibición de VEGF por tratamiento con Trap a diferentes tiempos sobre el crecimiento de los folículos ováricos.A) Campos representativos de secciones de ovario a 100X. a- Ovario Control; b. Ovario Trap. EAF: folículo astral temprano; Atf: folículo atrésico;POF: folículo periovulatorio; GC: célula de granulosa; TC: célula de la teca.B) a- Folículos preantrales. b- folículos antrales tempranos. c- folículos periovulatorios. d- folículos atrésicos. *: p<0.05; **: p< 0.01; n=6Figura 2: A) Campos representativos de secciones de ovario marcados con la técnica de TUNEL. a- Ovario control; b-Ovario Trap. Se muestra una porciónde cada sección a mayor aumento. EAF: folículo astral temprano; Atf: folículo atrésico; GC: célula de granulosa; TC: célula de la teca.B) Técnica de TUNEL. Se determinó el número de células apoptóticas por campo contando células marcadas en campos seleccionados al azar a 400X. Elnúnero de folículos analizados se muestra entre paréntesis.Se analizaron tres secciones /ovario (cinco ovarios/grupo). *p<0.05.Paired Student t-Test; n=5.La figura 3 muestra el contenido folicu-lar de las proteínas BCL2, BAX, BCLXs,BCLXL, FAS y FASL medidas por Westernblot. La inyección de Trap produjo unaumento significativo en los niveles deBAX (Control: 0.61± 0.05; Trap: 0.90 ±0.01, p<0.05, n=8) (Figura 3, A) y una dis-minución en los niveles de BCL2 (Control:2.08 ± 0.16; Trap: 1.35 ± 0.10, p<0.01, n=8)(Figura 3, B). La relación BCLXL/BCLXsdisminuyó significativamente en los folí-culos obtenidos de ovarios tratados conTrap (Control: 0.51± 0.02; Trap: 0.34 ±0.04, p<0.01, n=8) (Figura 3, C) observán-dose una disminución de  BCLXL mayorque la obtenida para BCLXs. No se obser-varon cambios significativos en los nivelesde FAS ni FASL (Figura 3, D y E). DiscusiónLos resultados descriptos en el pre-sente estudio revelan que la administra-ción intrabursa de una forma soluble deVEGFR1 para inhibir el efecto del VEGFproduce un aumento en la apoptosis encélulas foliculares ováricas obtenidas deratas tratadas con eCG y que los cambiosobservados en la expresión de las proteí-nas BAX, BCL2 y BCLX están involucra-dos en dicho efecto.La inhibición de VEGF con Trap produ-jo un aumento en el número de folículosatrésicos y una disminución en el númerode folículos periovulatorios en ovario derata tratada con gonadotropinas. Como laatresia es causada por apoptosis de lascélulas foliculares, examinamos el efectodel Trap sobre la muerte celular programa-da. La inyección de Trap produjo unaumento en el número de células de gra-nulosa apoptóticas en folículos antrales.Estos datos sugieren que el VEGF podríarescatar a las células de granulosa de laapoptosis e inhibir la atresia folicular.Tomando en cuenta estos resultadossugerimos que el VEGF desempeña unimportante rol en el desarrollo folicular yla atresia mediada por apoptosis. Unabuena vascularización o una alta perme-abilidad vascular en zonas cercanas a losfolículos en desarrollo podrían aumen-tar el aporte de factores endocrinos oparacrinos lo que resultaría en una dis-minución de la atresia y favorecería laselección del folículo. En nuestro mode-lo, se observó que el tratamiento conTrap produjo una disminución en la den-sidad de las células estromales con unaumento en el espacio extracelular. Sinembargo, no observamos diferencias enla permeabilidad vascular con el métodode azul de Evans. Se están realizando ennuestro laboratorio experimentos in vitropara estudiar un posible efecto directo deVEGF sobre las células de granulosa.Datos previos indican que el bloqueodel VEGF resulta en una menor prolifera-ción de células tecales en ovario de pri-mates no humanos (16), altera el desarro-llo folicular y la secreción de hormonas(4) e interfiere con la ovulación, la pro-ducción de esteroides y el desarrollo delcuerpo lúteo en mona (7,17).En el presente trabajo, los niveles deFAS y FASL no han sido modificados porel tratamiento con Trap. Estos resultadossugieren que la vía mitocondrial podríaestar involucrada en el aumento de laapoptosis. Las proteínas de la familia debcl2 son las principales participantes dela cascada de eventos de la vía mitocon-drial (18). Los miembros de esta familiapueden dividirse en proteínas proapoptó-ticas (como BAX y BCLXs) y antiapoptóti-cas (como BCL2 y BCLXL) y el balanceentre ambos tipos de proteínas determinael destino de la célula (19). En nuestroestudio, se observa una disminución de laexpresión de BCL2 y de la relaciónBCLXL/BCLXs y un aumento de BAX enfolículos tratados con Trap.En conclusión, la inhibición de la acti-vidad de VEGF produciría un aumento enla apoptosis ovárica mediado por un des-balance en la relación proteínas antiapop-tóticas/proapoptóticas llevando a unmayor número de folículos a la atresia. Elmecanismo podría ser a través de unaumento en el desarrollo de los vasos san-guíneos o bien a través de un efecto direc-to mediado por el receptor de VEGF encélulas de granulosa. Por lo tanto, el VEGFsería un factor limitante para el desarrollofolicular y la atresia. 3637Trabajo OriginalFigura 3: Efecto del tratamiento con Trap sobre el contenido de proteínas pro y anti apoptóticas en folículos antrales.A) Panel superior: Cuantificación densitométrica del contenido de BAX. Las barras representan la media ± SEM normalizadas contra b-actina. Panelinferior: Inmunoblot representativo del contenido de BAX en folículos antrales de ovarios de rata control y tratados. (n=8; p<0.05).B) Panel superior: Cuantificación densitométrica del contenido de BCL-2. Las barras representan la media ± SEM normalizadas contra b-actina.Panel inferior: Inmunoblot representativo del contenido de BCL-2 en folículos antrales de ovarios de rata control y tratados. (n=8; p<0.01).C) Panel superior: Cuantificación densitométrica del contenido de BCLX. Las barras representan la media ± SEM. Panel inferior: Inmunoblot repre-sentativo del contenido de BCLX en folículos antrales de ovarios de rata control y tratados. (n=8; p<0.01).D) Panel superior: Cuantificación densitométrica del contenido de FAS. Las barras representan la media ± SEM normalizadas contra b-actina. Panelinferior: Inmunoblot representativo del contenido de FAS en folículos antrales de ovarios de rata control y tratados. (n=8).E) Panel superior: Cuantificación densitométrica del contenido de FASL. Las barras representan la media ± SEM normalizadas contra b-actina.Panel inferior: Inmunoblot representativo del contenido de FASL en folículos antrales de ovarios de rata control y tratados. (n=8).Las acciones antiapoptóticas delVEGF en el ovario lo ubican como un fac-tor novel cuya expresión anormal podríallevar al desarrollo de diferentes enfer-medades relacionadas con la muerte celu-lar programada. Más aún, los resultadosdescriptos en este estudio podrían aclararcuáles son los mecanismos a través de loscuales el VEGF tiene un efecto sobre cier-tos desórdenes ováricos (como el síndro-me de ovario poliquístico o el síndromede hiperestimulación ovárica). El uso decompuestos antiangiogénicos podría con-tribuir al desarrollo de nuevas estrategiasterapéuticas en estas pacientes. Referencias1. 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