Se regeneraron plantas de Rhabdadenia Ragonesei Woodson (Apocynaceae) mediante el cultivo in vitro de explantes foliares en condiciones ambientales controladas. El procedimiento consistió en: 1) Desinfección de las hojas por inmersión en etanol al 70% (10 s) seguida de inmersión en NaOCl al 1,1% (15 min) y lavado tres veces con agua destilada estéril. 2) Inducción de callos y yemas mediante el cultivo de explantes foliares en el medio de Murashige y Skoog (MS) + 3 mg/L de benciladenina (BAP). 3) Subcultivo de callos y yemas en MS + 1 mg/L de BAP y 4) Enraizamiento de los vástagos obtenidos en MS + 0,5 mg/L de ácido naftalenacético.Plants of Rhabdadenia Ragonesei Woodson (Apocynaceae) were regenerated in vitro from leaves explants. The procedure employed includes: 1) Surface sterilization of leaves by immersion in 70% ethanol (10 s) followed by 1,1%NaOCl (15 min) and three wash with sterile distilled water. 2) Callus and buds induction by culture on Murashige and Skoog medium (MS) + 3 mg/L benzyladenine (BAP). 3) Subculture of callus and buds on MS + 1 mg/L BAP, and 4) Rooting on MS + 0.5 mg/L naftalenacetic acid.Fil: Flachsland, Eduardo Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; ArgentinaFil: Schinini Cacace, Aurelio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; ArgentinaFil: Terada, Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; ArgentinaFil: Furst, Graciela. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Mroginski, Luis Amado. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; Argentin

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BONPLANDIA 14(1-2): 91-96. 200591REGENERACIÓN DE PLANTAS DE RHABDADENIA RAGONESEI(APOCYNACEAE) POR CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTES FOLIARESEDUARDO FLACHSLAND1, 2, AURELIO SCHININI1, 3, GRACIELA TERADA1, 2, GRACIELA FURST 2, 4 & LUIS A.MROGINSKI1, 2, 5Summary: Flachsland, E., A. Schinini, G. Terada, G. Furst & L. A. Mroginski. 2005. Plantregeneration of Rhabdadenia Ragonesei (Apocynaceae) by in vitro culturing of leaf explants.Bonplandia 14(1-2): 91-96. ISSN: 0524-0476.Plants of Rhabdadenia Ragonesei Woodson (Apocynaceae) were regenerated in vitro fromleaves explants. The procedure employed includes: 1) Surface sterilization of leaves byimmersion in 70% ethanol (10 s) followed by 1,1%NaOCl (15 min) and three wash with steriledistilled water. 2) Callus and buds induction by culture on Murashige and Skoog medium (MS)+ 3 mg/L benzyladenine (BAP). 3) Subculture of callus and buds on MS + 1 mg/L BAP, and 4)Rooting on MS + 0.5 mg/L naftalenacetic acid.Key words: Rhabdadenia Ragonesei, Apocynaceae, Iberá, in vitro regeneration.Resumen: Flachsland, E., A. Schinini, G. Terada, G. Furst & L. A.  Mroginski. 2005. Regenera-ción de plantas de Rhabdadenia Ragonesei (Apocynaceae) por cultivo in vitro de explantesfoliares. Bonplandia 14(1-2): 91-96. ISSN: 0524-0476.Se regeneraron plantas de Rhabdadenia Ragonesei Woodson (Apocynaceae) mediante elcultivo in vitro de explantes foliares en condiciones ambientales controladas. El procedimientoconsistió en: 1) Desinfección de las hojas por inmersión en etanol al 70% (10 s) seguida deinmersión en NaOCl al 1,1% (15 min) y lavado tres veces con agua destilada estéril. 2)Inducción de callos y yemas mediante el cultivo de explantes foliares en el medio deMurashige y Skoog (MS) + 3 mg/L de benciladenina (BAP). 3) Subcultivo de callos y yemas enMS + 1 mg/L de BAP y 4) Enraizamiento de los vástagos obtenidos en MS + 0,5 mg/L deácido naftalenacético.Palabras clave: Rhabdadenia Ragonesei, Apocynaceae, Iberá, regeneración in vitro.1 Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE). Sargento Cabral 2131. Corrientes (3400). Argentina2 Facultad de Ciencias Agrarias (UNNE)3 Miembro Carrera de Personal de Apoyo del CONICET4 Becaria de Prestación de Servicios5 Miembro de la carrera del Investigador Científico, CONICET  Autor/correspondencia: Eduardo Flachsland: bifoliumar@yahoo.esIntroducciónLa flora nativa sudamericana posee una di-versidad genética, cuya conservación yaprovechamiento ha motivado la ejecución deproyectos regionales (Mc Nely & al., 1990;WCMC, 1992). Fomentar y dirigir estudios dealternativas de protección y manejo de losrecursos en aquellas áreas con vegetación re-92BONPLANDIA 14(1-2). 2005lativamente intacta, constituye una tarea prio-ritaria de los estados y de organismos guber-namentales, manifestado en el Convenio So-bre Diversidad Biológica ratificado por la Ar-gentina en la Ley 24.375/94. Por otra parte elinterés en la utilización ornamental de plantasnativas cobró impulso nacional en los últimosaños motivando numerosos estudios de pros-pección y domesticación de especies(Hashimoto & al., 2004).Rhabdadenia Ragonesei  Woodson(Apocynaceae) crece en los embalsados (islasflotantes), esteros, bañados, bajos y pantanosdel Macrosistema del Iberá, 12.000 km2 deáreas inundables ubicados en la Provincia deCorrientes, con una gran diversidad en flora yfauna (Arbo & Tressens, 2002). Es una plantavoluble, con ramas de 2-3 m de longitud,glabras, hojas opuestas, lineares y acumi-nadas, de 6-9 cm de largo y 1 cm de ancho,inflorescencia de 1-3 flores, corola rosado in-tenso o fucsia, tubo de 3-5 cm de longitud yfauce campanulada de 3 cm de diámetro, frutofolicular de 5-7 cm de longitud (Woodson,1940).Sus flores de llamativos colores, con libera-ción de un intenso perfume durante el atarde-cer y la noche (observación en cultivo), suma-do a un prolongado período de floración (Sep-tiembre-Marzo) la convierten en una plantamuy atractiva desde el punto de vista orna-mental, factible de ser mejorada para ser utili-zada en jardinería al igual que especies de losgéneros afines Allamanda L., MandevillaLindl. y Trachelospermun Lem. (Bailey,1949).Esta especie habita también en las provin-cias de Chaco, Formosa, Salta y Santa Fe(Ezcurra, 1999), donde crece también en am-bientes palustres. La fragilidad de estos am-bientes, sujetos a inundaciones, sequías y ex-plotaciones agrícolas, ganaderas o forestales,permiten considerar a RhabdadeniaRagonesei como una especie que puede serincluida en los planes de conservación degermoplasma vegetal del Macrosistema Iberá.Para otra especie, R. biflora Müll.Arg., ya sehan establecido áreas de conservación(www.inbio.ac.cr).Las técnicas de cultivo in vitro de tejidoshan demostrado su gran utilidad en la conser-vación de germoplasma, tanto a corto como alargo plazo (Roca & al., 1993; Engelmann,2000; Scocchi & Rey, 2004). Sin embargo,estas técnicas pueden ser utilizadas única-mente cuando se dispone de sistemas in vitroque brinden, como producto final, plantas en-teras.La regeneración in vitro de plantas a partirde diferentes explantes ha sido posible en nu-merosas especies (Lakshamanan & Taji,2000). Sin embargo, no existen antecedentesde trabajos con especies del géneroRhabdadenia.El objetivo de este trabajo es comunicar laregeneración in vitro  de plantas deRhabdadenia Ragonesei mediante el cultivode explantes foliares.Material y métodosSe trabajó con plantas de RhabdadeniaRagonesei coleccionadas en Laguna Luna28.03.49º S, 56.46.26º W, Dpto. Santo Tomé,Corrientes y depositadas en el herbario CTES(Arbo & al. 8570).Las plantas crecieron con un sustrato com-puesto de 60% de tierra negra de jardín, 20%de musgo Sphagnum y 20% de turba, las cua-les se cultivaron en un invernáculo provistode una malla de sombreado del 80%. Lasplantas fueron fertilizadas, cada 15 días, con 2g/l de Peter’s ® (7-45-15).Para la extracción de los explantes, las ho-jas expandidas en un 50% de su tamaño final,fueron desinfectadas en etanol al 70% (10 s)seguido de la inmersión en una solución de1,1% de NaOCl con el agregado de una gotade Tritón 100, durante 15 minutos. Finalmen-te, las hojas fueron lavadas tres veces conagua destilada estéril.Las hojas desinfectadas fueron seccionadastransversalmente en porciones de 25-35 mm2y en todos los casos se incluyó la vena media.Estos explantes fueron cultivados, con la caraadaxial en contacto con el medio de cultivo,en tubos de vidrio de 40 ml conteniendo 10 mlde medio de cultivo, en los cuales se sembrósólo un explante. Se cultivaron 10 tubos portratamiento con 3 repeticiones para cada va-93E. Flachsland & al., Regeneración in vitro de Rhabdadenia Ragonesei (Apocynaceae)riable. Todos estos trabajos se realizaron encondiciones estériles para lo cual se empleóuna cabina de flujo laminar.Los resultados obtenidos fueron analizadospor ANOVA y Test de comparación múltiplede Tukey con un nivel de significación de P<0,01.Para el establecimiento de los cultivos seutilizó el medio de cultivo compuesto por lassales minerales y vitaminas de Murashige &Skoog (1962), 3% de sacarosa y 0,65% deAgar Sigma A-1296 (MS) suplementado con0,1; 1 ó 3 mg/L de alguna de las siguientescitocininas: bencilaminopurina (BAP), cineti-na (KIN), 2-isopenteniladenina (2-iP), zeatina(ZEA) o thidiazurón (TDZ).El subcultivo de los callos y/o callos conprimordios de yemas se realizó sobre medioMS suplementado con BAP o TDZ, a razón de1 ó 3 mg/L o con 3 mg/L de 2-iP.El enraizamiento de los vástagos regenera-dos fue inducido en el medio MS, desprovistode reguladores de crecimiento o suplementa-do con 0,5 mg/L de ácido naftalenacético(ANA) o de ácido indolbutírico (IBA).El pH de los medios fue ajustado a 5,8antes del agregado del agar, con KOH y/oHCl. Los medios de cultivo fueron esteriliza-dos en autoclave a 1,46 kg.cm-2 durante 20minutos. Los tubos cultivados fueron cubier-tos con Resinite AF 50® (Casco S.A.C.I.F.,Bs. As.) y cultivados en condiciones de luz ytemperatura controladas a 27 ± 2° C con unfotoperíodo de 14 horas y 116 μmol.m2.s-1suministrado por tubos fluorescentes PhilipsTLD 36 W/840 Holland.Las plantas obtenidas in vitro fueron trans-feridas a macetas conteniendo un sustratoconstituido por turba, vermiculita y musgoSphagnum (1:1:1) y colocados en una cámaraclimatizada con 80% de humedad relativa.Resultados y DiscusiónLuego de la primera semana de cultivo, losmárgenes longitudinales de los explantesfoliares se curvaron hacia arriba sobre la venamedia, formando un tubo. Posteriormente apartir de las venas, en algunos de los mediosensayados, se generaron callos de color blan-co-verdoso y callos compactos de color verdeoscuro a verde-rojizo. Luego de 21 días decultivo fue posible observar la diferenciaciónen los callos, de yemas y vástagos (Fig. 1 A,B) seguida de una rápida oxidación delexplante foliar. En los medios que incluíanZEA, la oxidación se produjo en la primerasemana de cultivo.La siembra de los explantes en MS promo-vió el crecimiento de callo, sin embargo ladiferenciación de yemas o vástagos se obser-vó únicamente con la adición de ciertas con-centraciones de determinadas citocininas almedio MS (Fig. 2). En especial se destacó eltratamiento con 3 mg/L de BAP que posibilitóla inducción de callos y vástagos en un 83%de los explantes cultivados (Fig. 1 C). Valoressensiblemente menores se obtuvieron con elempleo de TDZ, 2-iP y KIN. Los explantescon ZEA no produjeron ninguna respuestamorfogenética y se oxidaron rápidamente(Fig. 2).El número de vástagos por callo tambiénfue influido por la citocinina empleada. Elmayor número de vástagos por callo (10) fueobtenido en MS + 1 mg/L de BAP, mientrasque 5,7 y 5,3 vástagos por callo fueron obteni-dos en los medios MS + 1 mg/L de TDZ y enMS + 3 mg/L de BAP, respectivamente. Estascitocininas generaron asimismo los mejoresresultados cuando se realizaron los subcul-tivos de callos conteniendo yemas (Fig. 3).En todos estos medios de cultivo, única-mente se desarrollaron vástagos. Esporádica-mente hubo diferenciación de raíces en el me-dio MS + 1 mg/L de BAP (Fig. 1 B).Este comportamiento diferencial de las dis-tintas citocininas en cuanto a su efectividad enla inducción de la caulogénesis, es frecuente-mente observado en el cultivo de tejidos (en-tre otros, Evans & al., 1981).Se observó que los vástagos de 4 cm delongitud y con 3 nudos diferenciados, subcul-tivados a medios frescos, enraizaron de mane-ra espontánea (Fig. 1 D).Los resultados muestran que el porcentajede los vástagos que forman raíces y el númerode raíces por vástago, fue modificado por elmedio de cultivo empleado en el estableci-miento de los vástagos (Fig. 4). Sin embargo,94BONPLANDIA 14(1-2). 2005Fig. 1. Regeneración de plantas de Rhabdadenia Ragonesei. A: Explante foliar a los 21 días de cultivado en medioMS + BAP 3 mg/L. La regeneración de callos y yemas se originan en la zona de corte (barra= 10 mm). B: Porción decallo y yemas creciendo en medio MS + BAP 1 mg/L luego de 21 días. Se observan algunas raíces originadas en labase del callo (barra= 5 mm). C: Callo con vástagos en MS + BAP 3 mg/L (barra= 30 mm). D: Vástago con 20 días deenraizado en medio MS + ANA 0,5 mg/L proveniente de MS + BAP 1mg/L (barra= 20 mm). E: Planta de 15 días deaclimatada en condiciones de invernadero y en plena brotación (barra= 25 mm)95E. Flachsland & al., Regeneración in vitro de Rhabdadenia Ragonesei (Apocynaceae)Fig. 2. Efecto de la adición al medio MS de tres concentraciones de citocininas sobre el cultivo de explantes foliaresde Rhabdadenia Ragonesei. Datos obtenidos a los 21 días de cultivo.Fig. 3. Efecto del agregado de citocininas al medio MS sobre la producción de vástagos en callos subcultivadosoriginados en explantes foliares de Rhabdadenia Ragonesei.Fig. 4. Efecto del medio de cultivo de origen en el enraizamiento de vástagos de Rhabdadenia Ragonesei.96BONPLANDIA 14(1-2). 2005el agregado de auxinas al medio de cultivo,tuvo un efecto significativo, destacándose eltratamiento de MS + 0,5 mg/L de ANA, en elcual se obtuvo un 76% de los vástagos concrecimiento de 3,6 raíces por vástago. Estosresultados, si bien concuerdan con los obteni-dos en la mayoría de las plantas en la necesi-dad de incorporar una auxina al medio decultivo para inducir rizogénesis (entre otros,Evans & al., 1981), también muestran quehasta un 13% de los vástagos enraizaron consolamente MS. Este hecho sumado a que tam-bién hubo formación de callos en medio MSsolamente (Fig. 2) sugiere que RhabdadeniaRagonesei produciría auxinas. Resultados si-milares se obtuvieron con la especieTrachelospermum asiaticum Nakai (Jazmínasiático), muy afín a la especie estudiada, endonde se obtuvo enraizamiento de segmentosuninodales utilizando el medio de WPM, sinel agregado de hormonas (Apter & al., 1993).Entre el 70 y el 100% de las plantas obteni-das in vitro de Rhabdadenia Ragonesei fue-ron transferidas al suelo y aclimatadasexitosamente (Fig. 1 E).En conclusión, este trabajo describe unprocedimiento de cultivo in vitro que permitela regeneración de plantas de RhabdadeniaRagonesei a partir de explantes foliares. Paraello las etapas fundamentales serían:1. Inducir la formación de callos y yemasmediante el cultivo de explantes de láminafoliar en el medio de cultivo de MS + 3 mg/lde BAP (durante 21 días).2. Subcultivar los callos y yemas en el me-dio de cultivo de MS + 1mg/l de BAP (duran-te 10 días).3. Enraizar los vástagos regenerados en elmedio de cultivo de MS + 0,5 mg/l de ANA(durante 15 días).BibliografíaAPTER, R. C., E. 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Plant regeneration of Rhabdadenia Ragonesei (Apocynaceae) by in vitro culturing of leaf explants

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