FIGUEIREDO, J. E. F.

KARAM, D.

SILVA, J. A. A.

Infoteca-e

Sete Lagoas, MGDezembro, 2013191ISSN 1679-1150AutoresJosé Edson Fontes FigueiredoBiólogo, Embrapa Milho e Sorgo. Cx. Postal 151. 35701-970, Sete Lagoas, MG. jose.edson@embrapa.brJéssica A. A. SilvaEngenheira Ambiental, bolsista da Embrapa Milho Sorgo. Cx. Postal 151.35701970, Sete Lagoas, Minas Gerais, jessicaalial@gmail.comDécio KaramEngº. Agrº., Plantas Daninhas, Embrapa Milho e Sorgo. Cx. Postal 151. 35701-970, Sete Lagoas, MG. decio.karam@embrapa.brO uso de herbicidas constitui uma prática comum na agricultura moderna visando reduzir as perdas de produtividade das culturas, sendo o grupo de moléculas agroquímicas mais comercializadas em todo o mundo (MENTEN et al., 2012). Somente no Brasil, 476 formulações com aproximadamente uma centena de ingredientes ativos estão registradas junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) (SCARDOELLI et al., 2011). Nas últimas décadas, o uso crescente desses produtos causou a contaminação dos solos agrícolas e dos lençóis freáticos (SEBIOMO et al., 2011) e gerou, consequentemente, grande interesse de diferentes setores da sociedade sobre os possíveis efeitos tóxicos dessas substâncias na microflora do solo (KONSTANTINOU et al., 2006). Alguns estudos mostraram que os herbicidas apresentam efeito inibidor sobre o crescimento de vários organismos do solo (WARDLE, 1995). Em outro estudo, os herbicidas glyphosate e imazaquin não causaram alterações significativas no teor de C da biomassa microbiana do solo, na respiração basal do solo e no quociente metabólico, mas ocasionaram alterações na comunidade bacteriana associada ao rizoplano de soja, na forma de restrição do crescimento de determinadas bactérias e estímulo de outras (ZILLI et al., 2008). Lancaster et al. (2010) encontraram aumento na população da bactéria Gram-negativa Burkholderia spp. após a aplicação de glyphosate no solo. Lane (2011) observou significante redução da biomassa total microbiana na rizosfera da soja após a aplicação do hebicida glyphosate, mas a estrutura populacional da comunidade microbiana não foi afetada. Partoazar et al. (2011) encontraram que a aplicação de glyphosate aumenta a população e a atividade microbiana do solo podendo apresentar efeitos, benéficos ou detrimentais, tanto para o crescimento das plantas como para a ecologia microbiana e para a qualidade do solo. Estudos sobre os efeitos dos herbicidas na atividade microbiana do solo de clima temperado foram conduzidos essencialmente por meio de análises diretas do solo e os resultados são conflitantes, possivelmente por causa do grande número de variáveis ambientais (MARTÍNEZ-TOLEDO et al., 1992). Por isso, torna-se necessário desenvolver métodos mais precisos para avaliar os efeitos de herbicidas nos microrganismos do solo e da rizosfera (POLEZA et al., 2008). Em solos de clima tropical, os estudos sobre o potencial de alteração das relações ecológicas dos herbicidas e suas interações ambientais são incipientes (KARAM et al., 2009). Microrganismos bioindicadores se desenvolvem junto à rizosfera de plantas superiores (ALTEMBURG et al., 2010; BORBA; AMORIM, 2007). Dentre esses, destacam-se especialmente as bactérias, apor causa da Efeito In Vitro de Glyphosate sobre Rizobactérias do Gênero Bacillus spp2 Efeito In Vitro de Glyphosate sobre Rizobactérias do Gênero Bacillus sppsua abundância, diversidade e capacidade de sobreviver em regiões sob as mais variadas condições ambientais. O grupo de bactérias Firmicutes apresenta relevância por estar envolvido em processos diversos, como biodegradação de contaminantes, biodisponibilização de nutrientes, fixação biológica de nitrogênio, e por serem utilizados em vários processos biotecnológicos (ZULU; VARISANGA, 2012). Várias dessas funções possibilitam o uso dessas bactérias em estudos de diagnóstico da qualidade ambiental e em recuperação de áreas sob impacto ambiental adverso (KARAM et al., 2009). Vários estudos têm demonstrado que bactérias patogênicas gram-positivas, tais como Salmonella entritidis, Salmonella gallinarum, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens e Clostridium botulinum, são altamente resistentes ao glyphosate. Contudo, a maioria das bactérias intestinais benéficas aos organismos, tais como Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacillus badius, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus spp. e Campylobacter spp., são moderadamente ou altamente suscetíveis ao glyphosate. Dessa forma, a redução de bactérias benéficas na microbiota gastrointestinal, pela ingestão de glyphosate, causa distúrbios no equilíbrio da comunidade bacteriana intestinal em aves domésticas. Além disso, a toxicidade do glyphosate para as bactérias do gênero Enterococcus spp., que é prevalente na flora intestinal de aves, pode aumentar a predisposição para infecções e está associada ao aumento de doenças causadas por C. botulinum por causa da supressão do efeito antagonista de Enterococcus spp. contra as bactérias do gênero clostridia (SHEHATA, et al., 2013).Figueiredo e Karam avaliaram o efeito in vitro do herbicida glyphosate [N-(phosphonomethyl)-glycine] sobre o crescimento de rizobactérias. Em um desses estudos (FIGUEIREDO et al., 2010), foram utilizadas 5 espécies de bactérias pertencentes ao gênero Bacillus: B. subtilis, B. licheniformis, B. anthracis. B. megaterium e B. thuringiensis, previamente isoladas da rizosfera da planta ornamental sempre-viva (Syngonanthus elegans var. elegans), nativa no Parque Nacional da Sempre-Viva (Município de Diamantina, Minas Gerais, Brasil).Os isolados foram cultivados em 1,5 mL de meio do tipo LB líquido (BERTANI, 1951), incubados a 28 °C e agitados a 180 rpm (rotações por minuto) durante 12 h. O crescimento microbiano foi monitorado por leitura espectrofotométrica (OD600). As culturas multiplicadas foram usadas em 3 tratamentos, em triplicata, contendo o herbicida glyphosate nas doses de 4 ppm e 8 ppm, além do controle, sem a adição do herbicida ao meio de cultura. O herbicida foi esterilizado com Millex Syringe filter de 33 mm (©Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha ) diretamente no meio de cultura líquido LB. Alíquotas de 100 mL de cada espécie bacteriana previamente crescidas até atingirem a OD600= 0,25 - 0,3 foram inoculadas  em 300 mL de meio LB, com e sem herbicida e incubadas a 28 °C em estufa agitadora, a 180 rpm, no escuro. O crescimento bacteriano foi monitorado em intervalos de tempo de 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 16 h e 20 h, por meio de leitura espectrofotométrica (OD600). O critério de avaliação consistiu da comparação das curvas de crescimento bacteriano, na presença e na ausência do herbicida glyphosate. Os dados referentes ao crescimento bacteriano foram plotados em função do tempo e das medições da OD600 (Figura 1) e foram submetidos a análise de variância pelo teste F a 5% de probabilidade (Systat 13, Systat Software, Inc., 2009) . O efeito de doses foi comparado pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade e o crescimento no período foi ajustado por meio de curva sigmoidal logística de três parâmetros utilizando-se o programa SigmaPlot 12.0 (Systat Software, Inc).3Efeito In Vitro de Glyphosate sobre Rizobactérias do Gênero Bacillus sppPela análise de variância observou-se ausência de efeito significativo para a interação período x concentração, por isto a derivação da análise foi para os fatores individuais. Na Figura 1, nota-se o crescimento diferenciado entre as cinco espécies do gênero Bacillus estudadas. Na Figura 2, observa-se o efeito negativo das concentrações de glyphosate no crescimento de B. anthracis. B. megaterium e B. thuringiensis com reduções na ordem de 2,74%, 4,18% e 5,44%, respectivamente, quando em ambiente com concentração de 8 ppm do herbicida. As diferentes doses do herbicida não apresentaram efeitos sobre o crescimento das espécies B. licheniformis e B. subtilis.Alguns autores têm sugerido que o glyphosate pode causar danos à ecologia bacteriana do solo e, consequentemente, provocar deficiência de micronutrientes para as plantas (DICK et al., 2010; FENG et al., 2005; HANEY et al., 2000; KING et al., 2001; PÉREZ et al., 2007; ROSA et al., 2010; TIRONI et al., 2009). Estudos sobre efeitos do glyphosate na biomassa e na atividade microbiana no solo, realizados por Haney et al. (2000) e Araújo et al. (2003), mostraram que o glyphosate foi rapidamente degradado por microrganismos, e que mesmo em doses muito elevadas, este herbicida não afetou a atividade microbiana. Figura 1. Curvas de crescimento de cinco espécies do gênero Bacillus em meio líquido, na ausência do herbicida glyphosate. D.O.= densidade óptica (D.O.= 600nm) medida por espectrofotômeto. Bacillus anthracis       - D.O.= 1,3390/(1+exp(-(x-3,7483)/1,8432)) r2= 0,986 Bacillus licheniformis - D.0.= 1,1022/(1+exp(-(x-3,2254)/2,0926)) r2= 0,990 Bacillus megaterium  - D.0.= 1,2079/(1+exp(-(x-2,1898)/1,4432)) r2= 0,955 Bacillus subtilis            - D.0.= 1,1569/(1+exp(-(x-3,6581)/2,2570)) r2= 0,982 Bacillus thuringiensis - D.0.= 1,2920/(1+exp(-(x-6,5138)/4,9785)) r2= 0,972  4 Efeito In Vitro de Glyphosate sobre Rizobactérias do Gênero Bacillus sppWeaver et al. (2007) relataram que o efeito do glyphosate na comunidade microbiana do solo é muito pequeno e apenas transiente.  Diferentes grupos de bactérias metabolizam o glyphosate por meio de uma via alternativa que cliva as ligações carbono-fosfato da molécula (DICK; QUINN, 1995; SANTOS et al., 2005) e muitos microrganismos utilizam o glyphosate como fonte de fósforo quando este elemento químico está ausente no meio (LIU et al., 1995; PIPKE et al., 1987). Vários trabalhos demonstraram o papel positivo desempenhado por diferentes espécies de Bacillus na decomposição de glyphosate (WALLNOFER, 1969; WALLNOFER; BADER, 1970). No estudo realizado por Figueiredo et al. (2010), o herbicida apresentou efeito negativo, in vitro, sobre o crescimento de três das cinco espécies de rizobactérias do gênero Bacillus avaliadas (B. anthracis. B. megaterium e B. thuringiensis ) e nenhum efeito, negativo ou positivo, sobre o crescimento de duas espécies B. subtilis e B. licheniformis. Esses resultados indicaram haver diferenças interespecíficas no gênero Bacillus com relação à habilidade de metabolizar o herbicida.AgradecimentosÀ Embrapa, CNPq e FAPEMIG.ReferênciasALTEMBURG, S. N.; LUZZARDI, R.; LOVATTO, P. B. The important role of biodiversity in organic soil quality in agricultural production systems: an approach for microbiology edaphic as bioindicators. Caderno de Pesquisa: Série Biologia, Santa Cruz do Sul, v. 22, n. 2, p. 18-36, 2010.ARAÚJO, A. S. 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B. anthracis     B. licheniformis   B. megaterium   B. subtilis      B. thuringiensis    5Efeito In Vitro de Glyphosate sobre Rizobactérias do Gênero Bacillus sppApplied Microbiology and Biotechnology, Berlin, v. 43, n. 3, p. 545-550, 1995.DICK, R. E.; LORENZ, N.; WOJNO, M.; LANE, M. Microbial dynamics in soils under long-term glyphosate tolerant cropping systems. In: WORLD CONGRESS OF SOIL SCIENCE, 19., 2010, Brisbane. Soil solutions for a changing world. Brisbane: International Union of Soil Science: ASSSI, 2010. 1 CD-ROM.FENG, P. C. C.; BALEY, G. J.; CLINTON, W. P.; BUNKERS, G. J.; ALIBHAI, M. F.; PAULITZ, T. C.; KIDWELL, K. K. Glyphosate inhibits rust diseases in glyphosate-resistant wheat and soybean. Proceedings of Natural Academic Science, v. 102, n. 8, p. 17290-17295, 2005.FIGUEIREDO, J. E. F.; SILVA, J. A. A.; LANZA, F. E.; COSTA, G. M. C.;  RAMOS, T. C. D. A.;  KARAM, D. 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MG 424 km 45 Caixa Postal 151CEP 35701-970  Sete Lagoas, MG Fone: (31) 3027 1100Fax: (31) 3027 1188E-mail: cnpms.sac@embrapa.br1a edição1a impressão (2013): on linePresidente: Presidente: Sidney Netto Parentoni. Secretário-Executivo: Elena Charlotte Landau. Membros: Dagma Dionísia da Silva, Paulo Eduardo de Aquino Ribeiro, Monica Matoso Campanha, Maria Marta Pastina, Rosângela Lacerda de Castro e Antonio Claudio da Silva Barros.Revisão de texto: Antonio Claudio da Silva Barros.Normalização bibliográfica: Rosângela Lacerda de Castro. Tratamento das ilustrações: Tânia Mara A. Barbosa. Editoração eletrônica: Tânia Mara A. Barbosa.  Comitê de publicaçõesExpedienteCircular Técnica, 191ZULU, J. N.; VARISANGA, M. D. Microbiology and mycology. African Virtual University. Disponível em: <http://www.out.ac.tz/avu/images/Biology/Microbiology 20and/20Mycology/.pdf>. Acesso em: 15 maio 2012.CGPE - 10994

Efeito in vitro de glyphosate sobre rizobactérias do gênero Bacillus spp.

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