При использовании современных требований к стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды, разработана спектрофотометрическая методика определения количественного содержания суммы флавоноидов в траве чабреца в пересчете на цинарози

Бубенчикова, В. Н.

Старчак, Ю. А.

DSpace at Belgorod State University

НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Р Я  Серия Медицина. Фармация. 2012. №22(141). Выпуск 20/1 157УДК 633.88:582.949.2:630*811.1ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ЧАБРЕЦА2)Орловский государственный университет1}Курский государственный медицинский университетВ.Н. БУБЕНЧИКОВА1 Ю.А. СТАРЧАК2При использовании современных требований к стандарти­зации лекарственного растительного сырья, содержащего фла- воноиды, разработана спектрофотометрическая методика опре­деления количественного содержания суммы флавоноидов в траве чабреца в пересчете на цинарозид. Данная методика вали- дирована по показателям линейности, повторяемости, воспроиз­водимости и правильности.e-mail:fg.ksmu@mail.ruКлючевые слова: чабрец ползучий, стандартизация, метод спектрофотометрии, валидация метода.Введение. Трава чабреца является официнальным лекарственным сырьем, включенным в ГФ XI издания, используемая в качестве отхаркивающего средства.Однако фармакопейная статья на траву чабреца не отвечает современным требованиям. Согласно данной ФС, качество сырья травы чабреца определяется по содержанию экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 70% [2]. Возрастающие требования к стандартизации лекарственного растительного сырья вызывают необходимость количественной оценки содержа­ния действующих веществ.Литературные данные и наши исследования свидетельствуют о наличии в растениях рода тимьян наряду с эфирным маслом флавоноидных соединений. Флавоноиды представлены как аг- ликонами: лютеолином и апигенином, так и их гликозидами: цинарозидом, космоссиином [4]. Поэтому нами предпринята попытка проводить стандартизацию сырья чабреца по содержанию флавоноидов.Целью работы являлось проведение валидации методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чабреца.Материалы и методы. Объектом исследования явилась трава чабреца, заготовленная в 2010-2011 гг. в Ботаническом саду КГМУ.На 1-м этапе нами проведены исследования по разработке методики количественного оп­ределения суммы флавоноидов.При разработке методики нами использован спектрофотометрический метод, основанный на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом, при котором происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 330-350 нм до 390-410 нм. В нашем случае при добавле­нии к спирто-водным извлечениям из травы чабреца, раствора алюминия хлорида в спектре полу­ченных растворов появлялся максимум поглощения при 395 нм, который совпадал с максимум поглощения цинарозида с алюминия хлоридом, что позволило проводить анализ при данной дли­не волны. Применение в качестве контроля исследуемого извлечения без алюминия хлорида по­зволило исключить влияние окрашенных сопутствующих веществ, а следовательно, исключить стадию очистки извлечений от экстрактивных веществ. Для получения более воспроизводимых результатов, реакцию комплексообразования вели в кислой среде.В ходе исследований были подобраны оптимальные условия экстракции: степень измель­чения сырья -  2 мм, экстрагент 70% спирт этиловый, соотношение сырья -  экстрагент 1:100, на­гревание в течение 60 минут.На основании проведенных исследований предложена методика количественного опреде­ления суммы флавоноидов с использованием в качестве стандартного образца цинарозида.Методика количественного определения флавоноидов: Около 1,0 г (точная навес­ка) измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл спирта этилового 70% и взвешивают с погрешностью ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному водяному холодильнику, нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 минут, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым искусственно охлаждают до комнатной температуры, взвешивают и при необходимости доводят до первоначальной массы спиртом этиловым 70 %. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр, смоченный тем же спиртом, отбрасывая первые 10 мл фильтрата (раствор А).158 НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Ш  Серия Медицина. Фармация. 2012. №22(141). Выпуск 20/1Раст вор сравнения. К 2,5 мл раствора А, добавляют 1 мл раствора кислоты уксусной 3% и доводят спиртом этиловым 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. 2,5 мл полученного раствора А  помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл раствора алюминия хлорида 5% спирте этиловом 70% и через 10 мин 1 мл раствора кислоты уксусной 3%. Объем раствора доводят тем же спиртом до метки. Через 30 минут измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и раствора стандартного образца на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 395 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя раствор сравнения.Содержание суммы флавоноидов в процентах (Х) в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляется по формуле:D х 100 х 100 х 100Х = ----------------------------------------------------------,345 х m х 4х V  х (100-W) где D -  оптическая плотность испытуемого раствора;345 -  удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом в 96% спирте этиловом;m -  навеска сырья в граммах;V  -  количество извлечения, в миллилитрах;W  -  влажность сырья, в процентах.Результаты и их обсуждение. Валидация методики проводилась по параметрам ли­нейности, повторяемости воспроизводимости и правильности методики [1-3].Определение линейности проводили на 6 уровнях концентраций. Вначале был приготов­лен исходный раствор СО цинарозида (ТУ 2638-014-80884467-10) с концентрацией 0,05%. Затем из него готовили разбавленные растворы, для этого в мерные колбы вместимостью 25 мл помеща­ли по 0,25, 05, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5 полученного раствора цинаррозида, прибавляли 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 70% спирте этиловом, перемешивали и доводили объем тем же растворите­лем до метки и снова перемешивали. Через 30 мин. измеряли оптическую плотность раствора на СФ-2000 при длине волны 395 нм, в кювете с толщиной слоя 10 мм в сравнении с контрольным опытом.СРис. Зависимость оптической плотности раствора от концентрациицинарозидаКритерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его вели­чина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. По полученным экспериментальным данным рассчитывали коэффициент корреляции, который должен быть не ниже 0,99. В нашем случае коэффициент корреляции составил 0,999 (рис., табл. 1).Таблица 1Результаты статистической обработки данных, полученных при изучении линейной зависимости вида у=вх+аF —х _ V в а R4 0,00175 0,603017 378,7029 -0,05971 0,999614Повторяемость методики определяли на том же образце сырья в 6 повторностях (табл. 2). Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, котороеНАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Р Я  Серия Медицина. Фармация. 2012. №22(141). Выпуск 20/1 159не должно превышать 10 %. Он составил 4,43%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.Таблица 2Определение повторяемости разработанной методики№ п/пСодержание суммы флавоноидов,%Метрологическиехарактеристики1 1,34 Хср.=1,358х2=0,0005908х=0,024290Ах=0,0бЕотн=4,43%Хср.=1,35±0,0б2 1,393 1,384 1,355 1,336 1,34Определение воспроизводимости методики выполняли 2 инженера-химика. Исследование проводили на 3 образцах в 3 повторностях (табл. 3).Таблица 3Определение воспроизводимости методикиПовторность АналитикСодержание суммы флавоноидов в перерасчете на лютеолин в сырье травы чабреца, %Образец 1 Образец 2 Образец 31 1 1,37 0,98 1,392 1 1,34 0,96 1,453 1 1,31 0,97 1,414 2 1,33 0,99 1,445 2 1,35 0,96 1,426 2 1,36 0,98 1,41Среднее значение 1,34 0,97 1,42Относительное стандартное отклонение (RSD), %4,20 3,35 3,97Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 15%. Он составил 4,20%, что указывает на прецизионность методи­ки в условиях воспроизводимости.Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в перерасчете на цинарозид в растворах, полученных путем добавления необ­ходимого количества стандартного вещества к исследуемому раствору. Критерий приемлемости -  средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скоррек­тированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 100%±5%. В разрабо­танной методике процент восстановления находился в пределах от 96,6% до 102, 4%. (табл.4).Таблица 4Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)Содержание суммы флавоноидов, мгДобавлено РСО цинарозида, мгВычислено с добавкой, мгПолученосодержание,мгОтносительная ошибка,%0,34 - 0,34 0,34 -0,34 0,25 0,59 0,57 96,6%0,34 0,50 0,84 0,86 102,4%0,34 0,75 1,09 1,11 101,8%В ходе проведенных исследований установлено, что разработанная методика легко воспро­изводима, доступна, занимает минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов. Анализ 5 образцов сырья чабреца показал, что содержание суммы флавоноидов в пересчете на ци­нарозид колеблется от 0,92 до 1,63%, что позволило предложить норму содержания действующих веществ не менее 0,9%. Полученные результаты включены в проект ФС «Чабреца трава»Выводы:1. Разработана методика количественного содержания флавоноидов в сырье чабреца.2. Установлены параметры линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильно­сти разработанной методики.160 НАУЧНЫЕ ВЕДОМОСТИ Серия Медицина. Фармация. 2012. №22(141). Выпуск 20/1Литература1. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Ч. 3: Промежуточные показатели прецинзионности стандартного метода измерений. -  М. : Госстандарт. -  28 с.2. Государственная фармакопея СССР 11-е изд., доп. -  Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. -  М. : Медицина, 1989. -  400 с.3. Мешковский, А.П. Валидация аналитических методов / А.П. Мешковский // Современные требования к организации и деятельности контрольно-аналитических лабораторий отделов контроля качества фармацевтических предприятий : сб.. -  М., 2002. -  С. 26-30.4. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 4. Семейства Caprifoliaceae -  Lobeliaceae / отв. ред. А.Л. Буданцев. -  СПб. ; М. : Товарищество научных изданий КМК, 2011. -  630 с.VALIDATION OF TECHNIQUES OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE FLAVONOIDS AMOUNT IN THE THYMUS HERBV.N. BUBENCHICOVA 1 Yu. A. STARCHAK21) Kursk State Medical UniversityA spectrophotometric method for determining the quantitative con­tent of flavonoids amount in the Thymusherb in terms of cinaroside has been developed with modern requirements for standardization of medi­cinal plants containing flavonoids. This methodology has been validated in terms of linearity, repeatability, reproducibility and accuracy.Orel State University Keywords: Thymus serpyllym L., standardization, method of spec­trophotometry, method’s validation.E-mail: fg.ksmu@mail.ru

Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чабреца

http://dspace.bsu.edu.ru/bitstream/123456789/18074/1/Bubenchikova_Validatsiya.pdf

Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чабреца

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

DSpace at Belgorod State University

DSpace at Belgorod State University