Analysis of the effect of the over-expression of recptor activator of Nf-kB (RANK) in estrogen receptor-positive breast cancer cells over tumour behaviour in vivo
Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017O cancro da mama é o segundo tipo de cancro mais frequente no mundo e o mais frequente na mulher. Segundo os últimos dados do GLOBOCAN, quase 2 milhões de casos de cancro da mama foram diagnosticados mundialmente em 2012. Em Portugal, o cancro da mama é o terceiro tipo de cancro com maior incidência e mortalidade, quando considerados ambos os sexos, apenas superado pelo cancro colo-rectal e cancro da próstata, sendo igualmente o mais frequente no sexo feminino. Com o desenvolvimento de novas terapêuticas e métodos de rastreio para deteção precoce, têm havido melhorias significativas nos outcomes clínicos de doentes com cancro da mama. Contudo, este continua a ser o quinto tipo de cancro com maior taxa de mortalidade a nível mundial, tendo sido responsável por 522 000 mortes em 2012. A principal causa de morte por cancro da mama deve-se ao desenvolvimento de metástases em locais secundários, sendo que 20 a 30% das mulheres que são diagnosticadas com cancro da mama em estadio inicial irão desenvolver metástases no curso da sua doença.
O cancro da mama é uma doença bastante heterogénea, quer ao nível clínico, quer ao nível morfológico e molecular. De acordo com características moleculares específicas, nomeadamente a expressão de recetores hormonais (RH) e HER2, o cancro da mama pode ser dividido em três subtipos principais, com diferentes implicações clínicas (prognósticas e terapêuticas): cancro da mama HR-positivo (luminal), que compreende cerca de 60% dos casos; cancro da mama HER2-positivo (HER2+), com aproximadamente 20% dos casos; cancro da mama triplo negativo (basal ou Claudin-low), com cerca de 30% dos casos. Entre os diferentes subtipos, o cancro da mama do tipo luminal apresenta o melhor prognóstico. Contudo, cerca de 30 a 40% das doentes com cancro da mama luminal desenvolvem metástases no prazo de 15 anos após o diagnóstico, sobretudo metástases ósseas (em 70% dos casos).
No contexto do cancro da mama, a via de sinalização do recetor ativador da via do NF-κB (RANK) – ligando do RANK (RANKL) tem sido alvo de inúmeros estudos dado o seu potencial terapêutico. Esta via é extremamente importante em três processos fisiológicos distintos: na remodelação óssea; no desenvolvimento da glândula mamária; e na ativação funcional de células do sistema imunitário, nomeadamente células dendríticas (DCs). Por outro lado, a via RANK-RANKL desempenha um papel fundamental na tumorigénese mamária e progressão tumoral de cancro da mama.
Estudos anteriores in vitro demonstraram que a ativação da via de sinalização RANK-RANKL afeta a capacidade de invasão de células de cancro da mama, induzindo transição epitélio-mesênquima (TEM) e expressão de marcadores de células estaminais tumorais. Em estudos com amostras clínicas de cancro da mama, a sobreexpressão de RANK tem sido principalmente associada a tumores triplo negativos. No entanto, estudos anteriores do nosso grupo permitiram demonstrar que a sobreexpressão do RANK numa linha celular de cancro da mama do tipo luminal (HR+), MCF-7, que expressa níveis endógenos baixos de RANK, leva à promoção da TEM, migração e invasão celulares, e aquisição de características de estaminalidade, aumentando a população de células CD44+/CD24-/low.
base nestes resultados, interrogámo-nos se a sobreexpressão do RANK em células de cancro da mama do tipo luminal poderá condicionar um fenótipo mais agressivo in vivo, sendo a resposta a esta questão o principal objetivo do presente estudo.
Assim, neste estudo foi utilizado um modelo animal de xenoenxerto ortotópico de células de cancro da mama do tipo luminal, por forma a podermos analisar o efeito da sobreexpressão do RANK em células MCF-7 no crescimento tumoral e invasibilidade do tumor. Foi utilizada a linha celular MCF-7GFP+Luc+, que permite seguir o crescimento tumoral in vivo por análise de bioluminescência, e células MCF-7 com sobreexpressão de RANK (MCF-7 RANK OE) foram derivadas da linha parental por transdução lentiviral. Foi ainda derivada uma linha de células MCF-7 RANK OERFP+, também por transdução lentiviral, por forma a podermos visualizar simultaneamente as duas populações em co-cultura ou co-inoculação.
As células tumorais, parentais ou RANK OE, foram inoculadas na glândula mamária de ratinhos NSG e, uma vez que o nosso principal objetivo era verificar se as células RANK OE seriam mais agressivas e invasivas, foi ainda inoculada uma mistura (1:1) dos dois tipos de células na mesma glândula mamária (grupo Mix). Cinco semanas após inoculação foi colhido sangue para identificação de células tumorais circulantes (CTCs). Os ratinhos foram sacrificados oito semanas após inoculação, os tumores foram seccionados e congelados ou fixados em formol e incluídos em parafina. Foram ainda colhidos sangue e medula óssea para identificação de CTCs e células tumorais disseminadas (DTCs), respetivamente, bem como órgãos viscerais (pulmões, fígado e baço) para deteção de metástases.
Por análise de bioluminescência verificámos que os tumores RANK OE e Mix apresentaram um menor crescimento do que os tumores do grupo parental (p<0.001), com um crescimento idêntico entre si. O menor crescimento deveu-se a um índice proliferativo inferior, medido pela imunodeteção de Ki67, dado corroborado pelos resultados in vitro, que demonstram que as células com sobreexpressão do RANK têm uma taxa de proliferação inferior à das células parentais.
Após análise das células constituintes dos tumores por citometria de fluxo, observámos que os tumores do grupo Mix eram predominantemente constituídos por células com sobreexpressão do RANK (média ~60% do total de células), o que sugere que células RANK OE apresentam uma vantagem adaptativa sobre células com baixa expressão deste recetor (parentais).
Apesar dos tumores serem mais pequenos, foram identificadas mais CTCs em ratinhos inoculados com tumores RANK OE ou Mix, cinco semanas após inoculação, quando comparando com ratinhos inoculados com células parentais (p<0.05). Para além disso, é de notar que as CTCs identificadas em ratinhos do grupo Mix foram maioritariamente RANK OE, sugerindo uma maior capacidade invasiva neste tipo de células. A hipótese de que as células RANK OE são mais invasivas foi também corroborada in vitro através de ensaios de migração, onde as células MCF-7 RANK OE apresentaram maior capacidade de migração do que células parentais, mesmo em co-cultura (p<0.001). Estes resultados são consistentes com o facto de os tumores com sobreexpressão do RANK terem expressão aumentada de marcadores mesenquimatosos (Vimentina, Snail e N-caderina), quando comparando com tumores parentais. Este resultado deverá ser confirmado por análise da expressão dos marcadores de EMT diretamente no tecido tumoral dos ratinhos (imunohistoquímica ou imunofluorescência).
Por último, observámos ainda que os tumores RANK OE e Mix apresentam um elevado grau de desmoplasia (p<0.05), estroma denso rico em colagénio, avaliado histologicamente por análise de secções coradas com Tricrómio de Masson.
Em suma, os resultados deste estudo sugerem a existência de uma correlação positiva entre a sobreexpressão do RANK em células de cancro da mama do tipo luminal e a aquisição de características mais agressivas, como maior desmoplasia e invasibilidade, para além de possuírem uma menor taxa de proliferação, que lhes poderá conferir resistência à quimioterapia.
Coexistindo num tumor “heterogéneo” com células com baixa expressão de RANK, as células que apresentam sobreexpressão deste recetor demonstram ter uma vantagem adaptativa, um resultado que necessita ainda de ser clarificado. Trabalhos futuros envolverão a co-cultura dos dois tipos de células e medição do crescimento celular específico, ou ainda a análise do crescimento celular em esferoides compostos pelos dois tipos celulares numa matriz 3D. Será ainda efetuado um estudo de sobrevivência e análise de CTCs e taxa metastização em modelo animal, comparando o efeito da inoculação das células RANK OE e parentais na mesma glândula mamária ou em glândulas contra-laterais.
Uma vez que a via de sinalização RANK-RANKL tem emergido como potencial alvo terapêutico em contexto adjuvante em cancro da mama, para além do seu papel como inibidor da reabsorção óssea em contexto metastático, é importante clarificar a contribuição desta via nos diferentes subtipos. Já foi demonstrado que a via RANK-RANKL está correlacionada com piores outcomes clínicos, desde sobrevivência global a doença livre de progressão, contudo está ainda por clarificar se a inibição desta via em cancro da mama poderá ter algum benefício para além do que possui no contexto da doença metastática do osso. Estudos futuros serão necessários para compreender de que forma a sobreexpressão de RANK em cancro da mama do tipo luminal se poderá correlacionar com a progressão tumoral, metastização e resistência à quimioterapia.Breast cancer (BC) is the second most common cancer in the world and the most frequent cancer among women. Most frequent BC are hormone receptor positive (HR+), commonly designated by luminal BC. Bone metastasis (BM) are the most frequent amongst metastatic BC and occur in about 70% of all HR+ BC cases, significantly decreasing the overall survival.
The receptor activator of NF-κB (RANK) pathway not only controls bone remodelling, mammary gland development and activity of dendritic cells, but is also involved in the BC onset and progression, as well as in the preferential metastasis of BC cells to bone. Despite clinical data points to overexpression of RANK mostly in HR- BC, previous studies have shown that RANK overexpression (OE) in luminal MCF-7 cells resulted in a mesenchymal transformation and increased stemness and migration potential. Therefore, we hypothesize that RANK+ luminal BC cells could have an enhanced invasion ability and that metastasis may be enriched for this subpopulation of cells.
In this study we used an orthotopic xenograft mouse model of luminal BC to study how RANK OE correlates with tumour burden and invasiveness. MCF-7 parental, RANK OE or both cell-types were inoculated in the mammary fat pad of NSG mice. RANK OE and Mix tumours exhibited a similar decreased growth rate, but an increase in CTCs, desmoplasia and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)-related genes. Predominant CTCs in the blood of Mix tumour-bearing mice and predominant cells in the Mix tumours were RANK OE cells.
Our results suggest that RANK OE cells present a more aggressive and invasive phenotype and that, when coexisting in the same tumour with cells with low RANK expression, RANK OE cells present an adaptive advantage. Although further studies are still required to elucidate RANK’s contribution in luminal-type BC, these findings can have high relevance since RANK pathway is emerging as a major target in BC treatment
