Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica (Sinais e Imagens Médicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020O cérebro é um órgão diferenciado sexualmente desde o período perinatal, caracterizado pelo seu dimorfismo sexual. Apesar de existir uma extensa documentação deste dimorfismo tanto a nível estrutural como a nível funcional, existe um certo enviesamento em investigação na área da neurociência. Estudos com apenas o sexo masculino são favorecidos, sendo que os resultados são depois extrapolados sem grande justificação, quando estes podem não se verificar para o sexo feminino. Esta prática é cada vez menos comum, sendo que a percentagem de estudos que incluem ambos os sexos subiu de 29% em 2009 para 63% em 2019. No entanto, apenas 20% destes realizaram uma análise com o sexo em consideração, e portanto diferenças sexuais são negligenciadas. Isto pode causar erros conceptuais e enviesamento não intencional em prática clínica. O hipocampo é uma área do cérebro considerada como sexualmente dimórfica, e está associado à consolidação de memórias de longo e curto prazo, e memória espacial. Tanto em humanos como em modelos animais, o sexo masculino supera o feminino no que toca à navegação espacial, enquanto que o contrário acontece com informação semântica. No entanto, a nível macroscópico, não se encontram diferenças sexuais na sua anatomia, visto que estas são eliminadas quando corrigidas pelo volume cerebral. Já a nível celular, foram encontradas diferenças entre ratos machos e fêmeas no que toca ao número de células na circunvolução dentada, assim como nos padrões de ramificação das dendrites, tanto das células da circunvolução dentada como das células piramidais. Porém, a maior parte dos estudos são focados na morfologia neuronal das células do CA3 e da circunvolução dentada, enquanto que poucos estudaram diferenças sexuais nos neurónios do CA1. Na primeira parte desta dissertação explorámos diferenças sexuais na morfologia dos neurónios piramidais do CA1. Para tal, utilizámos reconstruções neuronais disponíveis na base de dados Neuro Morpho.Org, analisando um total de 66 dendrites basais (33 de cada sexo) de ratos C57BL/6J (controlo). Realizámos uma análise de aglomeração de dados (clustering), onde encontrámos dois clusters, que separavam os neurónios de acordo com a sua dimensão. O cluster 1 contém os neurónios de maiores dimensões, enquanto que o cluster 2 contém os de menores. Para averiguar a existência de diferenças na morfologia escolhemos 9 variáveis que descrevem as propriedades principais de um neurónio: comprimento total das dendrites, comprimento máximo das dendrites, comprimento médio dos ramos dendríticos, raio do soma, raio da arborização dendrítica, volume da arborização dendrítica, número de pontos de ramificação dendrítica (bifurcação), ordem média dos ramos dendríticos, e retidão das dendrites. Os neurónios do sexo masculino do cluster 1 tinham significativamente maior comprimento total e comprimento máximo, maior volume e raio da arborização, e mais bifurcações que os neurónios do sexo feminino. Já no cluster 2, não foram encontradas diferenças significativas entre sexos. Já na segunda parte desta dissertação, quisemos fazer a ponte entre as diferenças neuromorfológicas que identificámos, e possíveis diferenças sexuais nas capacidades funcionais dos neurónios e na sua otimalidade. Desde a década de 1970 que existe o consenso de que as propriedades morfológicas do neurónio determinam a sua função, assim como influenciam a forma como este integra os sinais que recebe. Pequenas alterações são suficientes para perturbar os circuitos neuronais, como é o caso nas doenças neurológicas. No entanto, ainda não se sabe como a morfologia de cada célula afeta a rede neuronal. No fim do século XIX, Ramón y Cajal fez a primeira proposta sobre otimalidade neuronal, dizendo que as dendrites vão otimizar a sua conectividade ao minimizar o tempo de condução num compromisso com o custo material associado ao seu comprimento. Atualmente este conceito evoluiu, sendo proposto que a arborização dendrítica cresce de forma a preencher um espaço alvo, enquanto minimiza o tempo de condução e o custo. É portanto possível classificar um neurónio como ótimo ou subótimo, em que o ótimo é aquele que consegue chegar a todos os axónios que passam pelo seu espaço alvo, com o mínimo comprimento total. Utilizando este conceito de otimalidade, é possível fazer o salto entre morfologia e implicações na rede neuronal. Para aferir a otimalidade neuronal, utilizámos duas abordagens diferentes. Primeiramente, calculei duas leis de potência que relacionam propriedades morfológicas, e cujo expoente tem um valor otimal. Se um neurónio seguir a lei de potência, então é considerado como ótimo, caso contrário é subótimo. No entanto, com estas leis obtivemos resultados contraditórios, e elas mostraram-se como um método não confiável de aferir a otimalidade dos neurónios. A outra abordagem passou por definirmos uma otimização com múltiplos objetivos. Para tal calculámos três medidas de capacidades funcionais de um neurónio: o repertório de possíveis conexões, a eficiência na integração dos sinais, e o custo material. Estas três medidas comportam-se como uma configuração de Pareto, ou seja, é necessário atingir um balanço entre as três. Um neurónio ótimo é aquele que maximiza as primeiras duas medidas, enquanto minimiza o custo (multiobjetivos). Começámos por comparar cada uma destas capacidades funcionais individualmente, e no cluster 1 encontrámos diferenças significativas entre os sexos: os neurónios do sexo masculino tinham maior eficiência e repertório de conexões, mas também tinham um maior custo. Devido a terem um custo superior ao dos neurónios femininos, não é possível dizer diretamente que estes são mais ótimos ou não. Também comparámos o repertório e a eficiência após normalizá-los pelo custo, sendo que os neurónios do sexo feminino passaram a ser significativamente mais eficientes que os do masculino. Isto indica que os neurónios femininos são na verdade mais ótimos que os masculinos. Já nos neurónios do cluster 2, não encontrámos quaisquer diferenças significativas. Para poder determinar efetivamente a otimalidade de cada neurónio com esta abordagem, é preciso ter em consideração o balanço entre as três capacidades funcionais. Para tal, é necessário resolver este problema de otimização com múltiplos objetivos, e assim obter a fronteira de Pareto. A distância euclidiana entre cada neurónio e esta fronteira determina o quão próximo eles estão de ser ótimos. Uma vez que a eficiência na integração dos sinais foi obtida através modelos computacionais, foi necessário encontrar uma alternativa para obter a fronteira de Pareto. Neste caso, não obtivemos a verdadeira fronteira, mas sim escolhemos uma superfície que se adaptava aos dados. De acordo com a superfície que escolhemos como fronteira de Pareto, em ambos os clusters não encontrámos diferenças significativas entre os sexos. Comparando cada cluster, os neurónios do cluster 2 são significativamente mais ótimos que os do cluster 1. É de referir que se escolhêssemos outra superfície, os resultados seriam diferentes ao comparar os sexos no cluster 1, com os neurónios do sexo feminino significativamente mais ótimos, como era de esperar pelos resultados anteriores. Portanto, os resultados de otimalidade com esta abordagem também não são confiáveis, sendo que é necessário obter a verdadeira fronteira de Pareto. Para além destas análises, também realizámos análise de Sholl e calculámos a dimensão fractal e o enviesamento centrípeto. A análise de Sholl revelou uma maior complexidade nos neurónios do sexo masculino do cluster 1, mas não no cluster 2. A dimensão fractal, que é uma medida de quanto as dendrites ocupam o espaço, não revelou diferenças em nenhum dos clusters. O mesmo sucedeu para o enviesamento centrípeto, no entanto este revelou que existe um certo enviesamento. Isto significa que os neurónios favorecem uma diminuição no tempo de condução sobre um menor comprimento total. Em conclusão, encontrámos diferenças sexuais na neuromorfologia das dendrites basais do hipocampo CA1 de ratos C57BL/6J. Estas diferenças só se verificam nos neurónios de maiores dimensões, e influenciam as capacidades funcionais dos mesmos. Já os resultados sobre a otimalidade não eram confiáveis em nenhuma das abordagens, e portanto ainda não é possível fazer conclusões sobre a influência do sexo. No entanto, a nossa proposta de otimização de multiobjetivos é um primeiro passo na direção correta, e pode ainda ser melhorada.A remarkable feature of the human brain is its sexual dimorphism. While it is well-documented that the sexual dimorphism in brain structure and function exists, there is a sex bias in neuroscience research. Either single-sex male studies are favoured, or the works do not provide a sex-based analysis when both sexes are included. Experimental results obtained from research using only one sex are sometimes extrapolated to both sexes without thorough justification, which might cause conceptual errors and unintended biased practices. It has been suggested that the hippocampus is sexually dimorphic, although not at the macroscopic anatomical level, as sex difference was eliminated in meta-analyses of studies that correct for overall brain volume. Instead, at the cellular level, differences between male and female rats have been detected with respect to the number of dentate granule cells and branching patterns of dentate granule and hippocampal pyramidal cell dendrites. However, most studies focus on CA3 and dentate gyrus neuronal morphology, and few have studied sex-dependent differences in CA1 neurons. We explored sex-dependent differences in the dendritic morphology, functional capabilities and optimality of CA1 pyramidal neurons using digitally reconstructed neurons from the Neuromorpho.Org database. We analysed a total of 66 basal dendritic trees (33 of each sex) from control mice. Using cluster analysis, we identified two clusters, separated by size: neurons with larger (cluster 1) and smaller (cluster 2) average size. To assess sex differences in the morphology we chose 9 metrics describing the main features of a neuron. In cluster 1, male neurons present significantly larger total length, maximum path length, tree radius, volume and number of branch points. Sholl analysis also revealed increased complexity in male cluster 1 neurons. Instead, no sex-dependent differences in morphology nor Sholl analysis were identified in cluster 2. Fractal analysis assessed how much the dendrites filled their space, and there were no differences between sexes in either clusters. The same was true for centripetal bias, but it revealed that neurons favour faster conduction time over a smaller cable length. To assess neuronal optimality, we took two different approaches. We first applied known power laws and compared the exponents to their optimal value, but they proved to be unreliable to determine optimality. The second approach was a multi-objective optimization. We calculated 3 measures of functional capabilities which depend on neuromorphological properties: connectivity repertoire, signal integration efficiency and cable cost. An optimal neuron will maximize the first two, while minimizing the cost. Male neurons of cluster 1 had significantly higher connectivity repertoire and signal integration efficiency, but at a higher cost than females. After normalizing by cost, signal integration was significantly more efficient in female neurons of cluster 1. In cluster 2, no significant differences were found. To determine optimality, we defined a Pareto front using synthetic neurons and calculated the euclidean distance between this surface and each of the neurons from the dataset. In both clusters there were no significant differences, but neurons of cluster 2 were significantly more optimal than those of cluster 1. In conclusion, we found novel sex-dependent differences in the morphology of CA1 basal pyramidal neurons. Results on optimality varied according to the chosen Pareto front, and so no clear conclusions can be drawn. Nevertheless, our multi-objective approach is a first step in understanding sex differences
