Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Uma parte considerável da biodiversidade da Terra está presente em ecossistemas marinhos. Esta elevada e única biodiversidade marinha tem sido reconhecida como uma importante fonte de variabilidade química, estimando-se que anualmente são descobertos cerca de 1000 compostos de origem marinha. No entanto, o seu conhecimento científico e exploração comercial é ainda reduzido. Uma acumulação de dados científicos que comprovam os benefícios destes compostos marinhos nos mais variados sectores, desde os biocombustíveis, biomateriais, cosmética, alimentação funcional, têxtil, aplicações industriais para além da farmacêutica, tem conduzido a um aumento significativo dos esforços para investigar e isolar mais bioativos presentes nesta biodiversidade marinha. Dentro desta, os microrganismos marinhos têm sido alvo recente de uma maior atenção. Os microrganismos são já amplamente explorados em ambientes terrestres, mas ainda representam uma pequena parte dos compostos de origem marinha em comparação com outros organismos marinhos, como é o caso das macroalgas ou esponjas. A sua fácil manipulação e baixo impacto que a sua produção poderá ter no ecossistema são vistos como vantagens na exploração destes microrganismos. Uma outra forma de maximizar a diversidade química disponível de origem marinha, e seu potencial comercial, passa por estudar os microrganismos que habitam ambientes com condições de sobrevivência extremas, como fontes hidrotermais e oceano profundo. Nestes habitats, os microrganismos marinhos têm de possuir habilidades únicas, que lhes permitem adaptarem-se e responder ao seu ambiente de uma forma rápida, produzindo metabolitos secundários exclusivos que permitem a sua sobrevivência, defesa e competição. Estes metabolitos secundários são definidos como “armas bioquímicas” necessárias para competir, sobreviver e defenderem-se contra predadores e presas, sendo aceite pela comunidade científica que organismos que habitam as fontes hidrotermais deverão apresentar metabolitos secundários exclusivos. O principal objetivo desta tese foi desenvolver e implementar várias plataformas de rastreio rápido para identificar compostos bioativos com potencial antimicrobiano e antioxidante. A avaliação da qualidade global dos ensaios antimicrobianos e do ensaio da SOD1 para antioxidantes foi realizada utilizando o fator Z-prime, onde um ensaio excelente apresenta valores superiores a 0,5. Como fonte de potenciais bioativos foi utilizada uma biblioteca única de 227 extratos de microrganismos marinhos. Estes microrganismos foram isolados de 4 fontes hidrotermais: Menez Gwen, Rainbow, Monte Saldanha e Lucky Strike. A atividade antimicrobiana de compostos marinhos pode ser detetada através da observação da inibição de crescimento de vários microrganismos-teste na presença destes extratos naturais. Atualmente, existem diversos métodos usados para detetar bioatividade antimicrobiana, sendo que o ensaio de rastreio rápido antimicrobiano selecionado foi o método de diluição, onde o crescimento microbiano é observado através de sucessivas medições de densidade ótica. Sete estipes bacterianas foram selecionadas, tendo em conta uma listagem de bactérias cuja a descoberta de antibióticos é assumida como crucial, publicada pela World Health Organization, e a listagem de bactérias existentes no laboratório. Ao todo das 7 bactérias selecionadas, cinco ensaios de rastreio rápido foram primariamente desenvolvidos e validados para identificar bioatividade antimicrobiana contra diferentes estirpes, nomeadamente: Enterococcus sp. (VanA +), Klebsiella oxytoca, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium e Shigella sp. Estas sete bactérias foram submetidas a um rastreio primário, de onde resultaram 155 bioativos positivos. Estes primeiros bioativos positivos foram sujeitos a um rastreio secundário, onde se testou várias concentrações para um efeito dose-resposta, tendo sido identificados um total de 61 extratos bioativos positivos capazes de inibir 5 das 7 espécies de bactéria selecionadas: Enterococcus sp. (VanA+), Klebsiella oxytoca, Salmonella typhimurium e Salmonella enteritidis. Estes bioativos positivos reconfirmados serão no futuro submetidos a mais estudos, nomeadamente para elucidação da sua estrutura, e a técnicas de dereplicação para despistar compostos já conhecidos. No entanto, duas plataformas para rastreio antimicrobiano não foram totalmente validadas para HTS, a plataforma para Enterococcus faecalis e para Staphylococcus aureus, uma vez que os valores de Z’ foram inferiores ou iguais a zero durante o decorrer da experiência. Paralelamente, dois ensaios antioxidantes foram preparados, validados e implementados em laboratório para avaliar as propriedades antioxidantes dos compostos marinhos em estudo. As reações oxidativas podem envolver a produção de radicais livres, que podem desenvolver reações em cadeia perigosas e como tal há necessidade permanente de novos, e mais sustentáveis compostos bioativos antioxidantes. O teste do DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) foi otimizado e validado para a atividade antioxidante, através de medidas de atividade do DPPH scavenger. Este teste simples e rápido é baseado na inibição da acumulação de produtos oxidados, uma vez que a geração de radicais livres é inibida pela adição de antioxidantes e captura de radicais livres. O DPPH é um radical livre estável devido à deslocalização do eletrão sobresselente sobre a molécula como um todo e não pode dimerizar. Assim, evitando a sua agregação, é possível usá-lo para medir a atividade de scavenger de radicais livres de um composto, sendo que este radical na presença de um antioxidante captura o electrão livre. Foram identificados 30 extratos bioativos positivos que apresentam uma atividade scavenger superior a 80 %, sendo que o extrato LSWA081 se destacou por ter uma taxa de DPPH scavenger acima de 100%, superando inclusive um dos melhores antioxidantes conhecidos, o ácido ascórbico. Este composto foi coletado da fonte hidrotermal Lucky Strike. Cerca de 63 % destes poderosos DPPH scavengers foram extraídos, no entanto, de microrganismos isolados de Menez Gwen.
Para aumentar o significado biológico do rastreio de antioxidantes, foi também implementada uma plataforma para identificar extratos que consigam substituir a função da enzima SOD1, usando uma estirpe de levedura mutante de SOD1 pré-existente. Este gene codifica uma enzima que converte aniões superóxido em H2O2 e oxigénio, protegendo assim as células contra danos oxidativos. A levedura é um organismo modelo, adequado para programas de descoberta de bioatividade para aplicações antioxidantes, devido ao seu alto grau de conservação de processos biológicos e sua facilidade para manipulação genética, tempos de geração curtos, adaptabilidade genética e escalabilidade. Inicialmente, testes de validação foram realizados para avaliar a viabilidade do uso da Sacharomyces cerevisae sod1Δ:: URA3 como uma plataforma de rastreio rápido. Assim, foi realizada uma avaliação do crescimento em meio líquido suplementado com H2O2 e ácido ascórbico para caracterizar a estirpe de Saccharomyces cerevisae mutante. Foi observado que a levedura mutante na presença de H2O2, um indutor de stress, apresenta um retardamento no crescimento em comparação com a estirpe selvagem. Também no âmbito da caracterização das estirpes, procedeu-se à amplificação do gene SOD1 por PCR que confirmou que o gene SOD1 está presente na linhagem selvagem, correspondente a 609 pb, e não na estirpe sod1Δ :: URA3, como esperado. O fator Z 'foi calculado em cada ponto do tempo para a curva de crescimento da levedura inoculada, sendo que o fator Z considerado para a seleção do momento do ensaio no qual os resultados podem ser confiáveis e analisados corresponde a 24 horas desde o início do ensaio, onde o fator Z’ é de 0,60. Depois da validação do ensaio, foi realizado um primeiro ensaio de rastreio rápido, onde 8 bioativos positivos foram identificados. Estes terão de ser submetidos a um rastreio secundário posterior para serem revalidados em estudos dose-resposta, evitando, assim, possíveis falsos positivos. A maioria dos extratos identificados como bioativos positivos, tanto antimicrobianos como antioxidantes, tiveram origem na fonte hidrotermal Menez Gwen, um habitat marinho profundo muito ácido e de temperatura muito alta. É importante mencionar que alguns bioativos positivos apresentam tanto bioatividade antimicrobiana, como antioxidante e, portanto, são extratos microbianos marinhas com potencial elevado valor comercial que poderá valer a pena explorar no futuro. Os compostos MGBA001 e MGMS166O2 destacam-se por serem bioativos positivos para as três plataformas de rastreio rápido desenvolvidas. O MGBA001, apesar de ter uma baixa atividade antioxidante no ensaio SOD1, possui uma excelente atividade do DPPH (> 80%) e possui propriedades antimicrobianas contra as bactérias gram-positivas, Enterococcus sp. (VanA +) e Staphylococcus aureus. O trabalho realizado nesta tese pode ser a base de novos produtos naturais marinhos e programas de desenvolvimento de bioativos com relevância para uma variedade de indústrias, que incluem medicina e cosmética.Most life on Earth exists within the oceans that hold a great deal of biodiversity. Marine organisms show a wide bioactive diversity, with more than 1000 new compounds being discovered each year. Microorganisms, despite being deeply exploited in terrestrial environments, are still a relatively minor source of marine-based commercial compounds compared to other marine organisms. One way to maximize the chemical diversity available from marine sources, and their commercial potential, is to focus on microorganisms, as they are easier to collect and reproduce. Marine microorganisms can sense, adapt and respond to their environment quickly and can compete for defence and survival in extreme habitats, like deep sea hydrothermal vents, by producing exclusive secondary metabolites. The major goal of this thesis work was to develop assay platforms to screen bioactive compounds with antimicrobial and antioxidant potential from marine sources. As screening material a 227 marine microbial extracts library was used. Five screening assays were developed and validated for anti-microbial bioactivity screening against different strains, namely Enterococcus sp. (VanA+), Klebsiella oxytoca, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium and Shigella sp. Out of these, two failed to be fully validated, the Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus. From the initial 1135 marine extracts tested, 69 hits were found to inhibit the growth of specific pathogenic bacteria. In parallel, two antioxidant assays were set-up, validated and implemented in the lab to evaluate antioxidant properties of the marine compounds. The DPPH assay was optimized and validated through DPPH scavenger activity measurements and hit LSWA081 was found to be over 100% better than the current gold standard. To increase the biological significance, a SOD1 screening platform was also implemented from a pre-existing SOD1 mutant yeast strain. A primary SOD1 screening assay was performed and 8 new target specific hits identified, that still remain to be validated in a secondary dose-response secondary screening. The majority of the identified hits, both antimicrobial and antioxidant are derived from Menez Gwen hydrothermal vent, a very harsh acidic and very high temperature deep sea habitat. The work performed in this thesis can be the basis of novel marine natural products and bioactives development programmes with relevance to a variety of industries
