Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018A Diabetes mellitus (DM) é definida como uma desordem metabólica caraterizada por hiperglicemia crónica e alterações no metabolismo de glícidos, lípidos e proteínas devido à insuficiente secreção e/ou ação de insulina. A DM pode ser dividida em duas grandes classes: a Diabetes tipo 1 (T1DM) que engloba 5-10% dos casos de doença e carateriza-se pela ocorrência da destruição auto imune das células β do pâncreas. A segunda classe denomina-se de diabetes tipo 2 (T2DM), inclui 90-95% dos indivíduos com diabetes e neste caso existe uma insuficiente secreção de insulina e/ ou resistência à sua ação. A T2DM pode persistir sem diagnóstico por muitos anos até ser detetada e consequentemente estes indivíduos apresentam um elevado risco de desenvolvimento de complicações macrovasculares e microvasculares. Na realidade, em 2015 estimou-se que 13,3% da população portuguesa entre os 20 e 79 anos de idade sofriam de T2DM e 44% destas pessoas ainda não tinham obtido um diagnóstico. A elevada prevalência, complexidade clínica e natureza crónica da DM representam um enorme encargo médico e socioeconómico tornando urgente o desenvolvimento de novas estratégias de diagnóstico e de terapia. Uma das caraterísticas frequentemente observadas nas autópsias de indivíduos com T2DM é a presença de depósitos amilóides no pâncreas e as evidências sugerem que os agregados tóxicos de uma proteína denominada Polipéptido Amilóide dos Ilhéus (IAPP) contribuem para a disfunção e a perda das células β pancreáticas. A IAPP é uma proteína neuro-endócrina de 37 resíduos de aminoácidos, codificada por um gene localizado no cromossoma 12 em humanos e expresso nas células β pancreáticas. O péptido é expresso, armazenado e secretado em resposta aos mesmos estímulos que a insulina e embora a sua função ainda não seja clara, é reconhecido um papel na homeostase da glucose. A sequência imatura de IAPP é uma pré-proproteína composta por 89 resíduos de aminoácidos - pré-proIAPP (ppIAPP) - cujo péptido sinal é hidrolisado no retículo endoplasmático (ER). Após remoção do péptido sinal, a proIAPP (pIAPP), uma pro-proteína de 67 resíduos, sofre a ação das mesmas enzimas responsáveis pelo processamento de proinsulina a insulina: prohormona convertase 1/3 (PC 1/3) e prohormona convertase 2 (PC2) para a formação da proteína madura – IAPP. Apenas os humanos, primatas não humanos e gatos expressam uma proteína altamente amiloidogénica, contrariamente ao que acontece com os roedores. Uma diferença em apenas seis resíduos de aminoácidos torna a proteína humana susceptível à oligomerização, em oposição ao que acontece com os roedores. A existência de regiões amilodoigénicas no péptido, a sobreexpressão da proteína como consequência do aumento da expressão de insulina (resultado da resistência periférica à sua ação) e erros no processamento das formas imaturas da proteína são fatores que podem ser associados à formação de agregados de IAPP. No entanto, os mecanismos moleculares que desencadeiam a agregação da proteína ainda não são totalmente conhecidos. A levedura Saccharomyces cerevisiae é um organismo eucariota frequentemente utilizado como modelo experimental. Possui um sistema genético bem definido, é de fácil manipulação, não patogénico e a sua utilização apresenta custos relativamente baixos. Alguns dos processos celulares fundamentais são conservados entre a levedura e os humanos e cerca de 31% dos genes da levedura possuem homólogos em mamíferos. Este organismo é frequentemente utilizado para estudar processos biológicos complexos como a replicação de DNA, progressão do ciclo celular, transdução de sinal e outros mecanismos relevantes. Mesmo os genes humanos que não possuem um homólogo em levedura podem ser estudados neste organismo, através de expressão heteróloga, para dar origem aos denominados modelos de leveduras humanizadas. Estes modelos eucariotas foram já validados para o estudo de algumas doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson e conseguem recapitular algumas das caraterísticas da doença. Assim, foram previamente desenvolvidos modelos de levedura que expressam a forma humana de ppIAPP (pphIAPP), pIAPP (phIAPP) e IAPP (hIAPP) marcadas com GFP (green fluorescent protein) utilizando vetores epissomais de múltiplas cópias. No entanto, a instabilidade destes vetores gera artefactos técnicos que dificultam a interpretação dos resultados. Para contornar esta limitação, neste estudo foram desenvolvidos modelos optimizados de expressão do IAPP através da integração do cDNA que codifica para o hIAPP, phIAPP and pphIAPP no genoma da levedura. Estes modelos são valiosos para a investigação das propriedades citotóxicas da proteína madura e imatura, que representou o segundo objectivo deste estudo. Uma das principais conclusões deste trabalho é que, tal como acontece na agregação da α- sinucleína, uma cópia do gene de pphIAPP e phIAPP é insuficiente para que o crescimento da levedura seja comprometido, apesar de a sua expressão afectar alguns parâmetros de crescimento como a duração da fase lag, que reflete o tempo necessário para a duplicação celular, e a biomassa final. No caso das células que expressam hIAPP o crescimento demonstrou ser ligeiramente afetado pela expressão da proteína mas a citoxicidade foi bastante inferior aos resultados obtidos com as estirpes que expressam os vetores de múltiplas cópias. Posto isto, o modelo foi optimizado através da introdução de uma segunda cópia do respetivo cDNA no genoma das estirpes recombinantes. A expressão de duas cópias da construção de phIAPP foi suficiente para que a maioria dos parâmetros relacionados ao crescimento celular fossem afetados. Mais, as estirpes foram sujeitas a ensaios de microscopia de fluorescência onde foram detetados sinais de stress celular, como a presença de largos vacúolos nas células, associados à expressão destas proteínas. A expressão de duas cópias de phIAPP teve um impacto mais drástico no crescimento celular e levou ainda à acumulação de agregados no vacúolo. Curiosamente, não foi possível detetar a proteína pphIAPP nos ensaios de microscopia de fluorescência, o que pode sugerir que o transcrito desta proteína possa ser instável ou que a proteína possa ser degradada como estratégia de defesa celular. Ensaios adicionais são necessários para corroborar esta hipótese. A expressão das formas não processadas de hIAPP foi testada por immunoblotting e os resultados indicam a presença de diversos intermediários de processamento sugerindo que convertases endógenas processam a pphIAPP, o que pode ocasionar a remoção do tag de GFP. A presença de agregados de IAPP nas células β do pâncreas está bem documentada. Estes agregados foram não só detetados no pâncreas dos indivíduos, mas também em outros órgãos, nomeadamente nos rins de indivíduos com nefropatia diabética e no coração de pessoas com excesso de peso e/ou obesidade e em indivíduos diagnosticados com T2DM. Estes depósitos podem ser correlacionados com o dano nos tecidos onde se encontram. Depósitos da proteína podem ser também encontrados no cérebro de indivíduos diagnosticados com a doença de Alzheimer ou demência e simultaneamente de T2DM. Uma vez que as espécies oligoméricas de IAPP presentes no cérebro parecem ser transportadas a nível circulatório e o nível de expressão de IAPP no cérebro é muito baixo, é sugerido que oligómeros de IAPP expressos no pâncreas possam circular na corrente sanguínea e alojar-se em diferentes órgãos com consequências nefastas para os tecidos. De fato, foram já detetados tetrâmeros de IAPP em amostras de plasma humano. Este é um resultado importante para a exploração dos oligómeros de hIAPP como um potencial indicador da diabetes. Desta forma, foram realizados diversos ensaios para a deteção de oligómeros de IAPP no plasma de voluntários saudáveis e em voluntário diagnosticado com diabetes. Através da utilização de um anticorpo que reconhece o epítopo dos resíduos 20-29 da hIAPP foi detectado um sinal de cerca de 22-24 kDa que pode efectivamente corresponder a oligómeros hIAPP.The accumulation of amyloid deposits in the pancreas is a histopathological hallmark of type 2 diabetes. Evidences suggest that intermediate oligomeric species, rather than the amyloid structures primarily composed of the Islet Amyloid Polypeptide (IAPP) hormone, contribute to β-cell dysfunction and loss. Human IAPP (hIAPP) is an amyloidogenic polypeptide expressed in pancreatic β-cells as a proprotein. IAPP and insulin are co-expressed, processed by the same enzymes and co-secreted in response to the same cellular stimulus, leading to the concerted regulation of their activity towards whole-body glucose homeostasis. The molecular mechanisms underlying hIAPP intracellular oligomerization leading to the accumulation of amyloid plaques in the pancreas is still poorly understood. Humanized yeast models of IAPP expression were previously constructed to facilitate the investigation of the intracellular effects of IAPP. With the goal to overcome limitations of the previous models, this study intended to construct improved models by integrating the cDNA encoding for mature and unprocessed hIAPP forms into the genome, the latter referred as the most amyloidogenic species. The construction of novel models allowed the investigation of the cytotoxic properties of hIAPP forms, revealing that overexpression of proIAPP more drastically impaired cellular growth and led to the accumulation of hIAPP aggregates in the vacuole. In addition, the models were shown to be valuable tools to investigate hIAPP processing as convertase activity is evolutionary conserved. hIAPP expressed in the pancreas circulates in the bloodstream being distributed to target tissues. Since the accumulation of hIAPP oligomers precedes the deposition of pancreatic amyloids, it was hypothesized that detection of hIAPP oligomers in the plasma could serve as an early indicator of diabetes. Preliminary analyses indicated the presence of ~22-24 kDa signal potentially representing hIAPP oligomers in the plasma sample of a volunteer diagnosed with diabetes. Further studies are required to address the significance of these results
