Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Staphylococcus aureus é um dos maiores patógenos oportunistas, sendo responsável por um grande número de infeções. Atualmente, as estirpes de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) são consideradas um grande problema de saúde pública, tanto no controlo da infeção como no seu tratamento. Na verdade, S. aureus é uma das causas mais comuns de infeções em ambiente hospitalar. Por esta razão, não só é importante explorar e perceber os mecanismos por de trás dessa múltipla resistência a antibióticos, mas também compreender melhor os fatores que permitem a este microrganismo viver e sobreviver em diferentes condições.
A diversidade metabólica deste organismo permite-lhe sobreviver em diferentes ambientes, fazendo deste um patógeno tão perigoso. Apesar disso e surpreendentemente, a cadeia respiratória deste organismo é muito simples e o seu metabolismo é pouco explorado. Enzimas constituintes da cadeia respiratória apesar de ser identificadas como drug target em diferentes patologias como é o caso da malária, continuam a ser muito pouco estudadas. No caso das enzimas da cadeia respiratória de S.aureus pouca informação pode ser encontrada sobre estas proteínas na literatura. Por isso este trabalho aqui desenvolvido no âmbito desta dissertação pretende contribuir para o alargamento do conhecimento acerca do metabolismo energético desta bactéria. Este projeto de dissertação focou-se na expressão e purificação da Dihidroorotato: quinona oxidorreductase de S. aureus; e na caracterização bioquímica e celular de três quinonas redutases expressas pelo mesmo organismo e que estão envolvidas em diferentes vias metabólicas de produção de energia, a Dihidroorotato: quinona oxidorreductase (DHOQO); a Glicerol-3-fosfato: quinona oxidorreductase (G3PQO) e a Piruvato: quinona oxidorreductase (PQO). Estas enzimas catalisam a oxidação de diferentes substratos e a redução da quinona a quinol, fornecendo eletrões à cadeia respiratória. Estas proteínas são caracterizadas como flavoproteínas uma vez que apresentam flavina como cofator, o que lhes confere não só o espectro UV-visível característico das flavoproteínas com bandas a 375 nm e a 450 nm, mas também a cor amarela às amostras que contêm as proteínas de interesse. A DHOQO, G3PQO e a PQO são também classificadas como enzimas monotópicas, uma vez que estão apenas presentes num lado da membrana e se encontram ligadas a esta através de interações eletrostáticas. A DHOQO é uma enzima que catalisa a oxidação do dihidroorotato a orotato, sendo os eletrões transferidos para a quinona, através do seu cofator FMN. Esta reação enzimática é a única reação de oxidação-redução e corresponde ao quarto passo da via de biossíntese das pirimidinas. A DHOQO expressa em S. aureus é codificada pelo gene pyrD e tem a massa molecular teórica de 39 kDa. No caso da G3PQO, esta catalisa a oxidação do glicerol 3-fosfato a dihidroxiacetona fosfato com transferência de eletrões para a quinona. Em S. aureus esta enzima é codificada pelo gene glpD e é uma enzima com 62 kDa. Ao contrário das outras duas quinona redutases, a PQO apresenta além da flavina, o TPP e o Mg 2+ como cofatores, catalisando a descarboxilação oxidativa do piruvato a acetato e CO2 com transferência de eletrões para a quinona. A PQO expressa em S. aureus é uma enzima com 63 kDa e que é codificada pelo gene CidC. Neste trabalho expressámos e purificámos a DHOQO com sucesso, tendo-se feito a caracterização bioquímica e celular da DHOQO, G3PQO e PQO. Além da caracterização bioquímica, o estudo da DHOQO foi complementado ao nível celular através da comparação do crescimento da estirpe wild type e estirpe mutante knockout da proteína DHOQO. Estas três proteínas em estudo foram caracterizadas espectroscopicamente tendo sido também testada a sua estabilidade térmica e investigado o seu estado de oligomerização. O respetivo grupo prostético foi também identificado. No caso da DHOQO, esta foi funcionalmente caracterizada através de estudos cinéticos, do perfil de pH e de estudos de interação de proteína substratos. A G3PQO e a PQO foram identificadas como enzimas diméricas e que apresentam FAD como cofator. Pelo contrário, a proteína monomérica DHOQO tem como cofator FMN e mostrou ter atividade de dihidroorotato:quinona oxidorreductase, sendo inibida pela presença em solução de HQNO (conhecido inibidor de quinonas redutases). Ensaios de quenching de fluorescência foram feitos para o estudo da interação de proteína e substratos (DMN, duroquinona, os respetivos dadores de eletrões e HQNO). Nestes estudos os resíduos de triptofanos são excitados a 295 nm, sendo observada uma diminuição na emissão de fluorescência dos mesmos. O quenching observado na emissão da proteína deve-se a mudança de ambiente químico dos resíduos de triptofanos causado pela mudança de conformação das proteínas induzida pela interação da enzima e do substrato. Os nossos dados experimentais mostraram que as três quinona redutases apresentam uma maior afinidade para a menaquinona (DMN) do que para a duroquinona (Benzoquinona), estes dados estão de acordo com o facto de S. aureus sintetizar menaquinona naturalmente. Os mesmo estudos de quenching de fluorescência sugerem também que a ligação da quinona (DMN) e do dihidroorotato, no caso da DHOQO, parece ser feita em dois locais de ligação diferentes, uma vez que a presença do inibidor HQNO, afeta apenas a interação da quinona com a proteína. Na caracterização celular, o objetivo principal foi a obtenção de mutantes knockouts da DHOQO, G3PQO e da PQO. Este processo de obtenção de mutantes envolve 5 passos principais: 1) amplificação dos fragmentos up e down (aproximadamente 1300 pares de bases upstream e 1300 pares de bases downtream do gene que codifica para a proteína de interesse, respetivamente); 2) Obtenção de fragmento overlap através de overlapping PCR; 3) Clonagem de fragmento up-down de cada proteína no vector de clonagem pMAD; 4) Electroporação em S. aureus RN4220; 5) Transdução de S. aureus MW2. A recombinação e a integração do plasmídeo no genoma de S. aureus são obtidos através de um processo de recombinação homóloga que envolve dois passos principais, a integração e a excisão. No primeiro passo, os recombinantes são selecionados a uma temperatura não permissiva para a replicação do plasmídeo (43 ºC), usando eritromicina e a cor azul das colónias (devido a metabolização de X-gal). Num segundo passo, as células são incubadas a 30 ºC na ausência de seleção por antibiótico. Neste passo, as colónias brancas resultantes são aquelas em que o vector foi excisado com sucesso. No caso da G3PQO e da PQO os mutantes knockout não foram obtidos, enquanto para a DHOQO foi obtido com sucesso. A obtenção destes mutantes para as três quinonas redutases permite-nos a investigação do papel e relevância destas proteínas no metabolismo deste perigoso patógeno, estudando assim o efeito da deleção destas proteínas no crescimento/ metabolismo energético de S. aureus. Para isso, crescimentos das estirpes wild type e mutada para a proteína DHOQO foram realizados. Durante os crescimentos foram monitorizadas a densidade celular óptica a 600 nm e o valor de pH. Crescimentos com estirpe wild type e a estirpe mutante da proteína DHOQO revelaram que DHOQO parece ter um papel relevante no metabolismo de S. aureus, uma vez que foram observadas diferenças tanto no crescimento como no perfil de pH das duas estirpes em estudo.Staphylococcus aureus is a major human opportunistic pathogen that causes a wide range of clinical infections. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) have been considered a serious and worldwide problem to public health. The variable metabolic capacities allow S. aureus to adapt to different conditions. However and surprisingly the respiratory chain of S. aureus is quite simple, and the metabolism of this pathogen is still very little explored. This thesis focused on the expression and purification of the Dihydroorotate:quinone oxidoreductase from Staphylococcus aureus; and biochemical and cellular characterization of three quinone reductases from the respiratory chain of the same organism: Dihydroorotate:quinone oxidoreductase (DHOQO), Glycerol-3-phosphate:quinone oxidoreductase (G3PQO) and Pyruvate:quinone oxidoreductase (PQO). These proteins catalyze the oxidation of the different substrates (electron donors) and the reduction of the quinone (electron acceptor) to a quinol form, providing electrons to the respiratory chain. In this work, the expression and purification of DHOQO from S. aureus was achieved and successful biochemical and cellular characterizations of DHOQO, G3PQO and PQO were performed. From the protein biochemical point of view, G3PQO and PQO are identified as dimeric enzymes, presenting FAD as cofactor. By contrast, the monomeric protein, DHOQO was shown to have an FMN molecule as a cofactor and it was shown to be purified in a redox active state. Protein substrate interaction studies showed that the three proteins under study have higher affinity to DMN, a menaquinone analogue (which is the physiological quinone found in the membranes of Staphylococcus aureus). These studies also suggested that the binding of quinone and dihydroorotate (the electron donor of DHOQO) seem to take place at different binding sites, since the presence of the inhibitor HQNO only affected the interaction of the protein with the quinone. For a cellular role characterization, we aimed to construct knockout mutants for the three quinone reductases. The knockout mutant of the DHOQO (ΔDHOQO) was successfully obtained and growth studies of ΔDHOQO revealed that DHOQO is relevant and impacting in the metabolism of the S. aureus
