Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Na atualidade, tem havido cada vez mais a procura por um estilo de vida saudável e grande parte dele advém da alimentação. Como tal, nesta área tem-se investigado os compostos que vários alimentos têm e os seus benefícios para a saúde, nomeadamente as algas. Estas têm sido estudadas devido às suas capacidades antioxidantes e anti-obesidade e é neste âmbito que se iniciou este trabalho experimental, centrado no estudo de Undaria pinnatifida. Começou-se então por liofilizar a alga para obtermos o material inicial para desenvolver o trabalho. De seguida, efetuaram-se duas decocções, que permitiram a extração dos compostos de U. pinnatifida e a obtenção de extratos aquosos. A primeira durante 24 horas sob agitação à temperatura ambiente (W24) e a segunda durante 30 minutos a 100 º C (W100). A ambas foi feita a precipitação de mucilagens, com o objetivo de obter um sobrenadante constituído maioritariamente por compostos fenólicos, obtendo-se assim um total de quatro extratos: cozida durante 30 minutos, com e sem mucilagens, e 24 horas sob agitação, a temperatura ambiente, com e sem mucilagens. De seguida, determinaram-se as atividades biológicas destes quatro extratos tendo-se quantificado os fenóis totais, avaliado a capacidade de redução do radical DPPH e de inibição dos enzimas acetilcolinesterase e HMGR. Destes ensaios chegou-se à conclusão de que o melhor extrato é o da alga cozida durante 30 minutos, uma vez que apresenta uma maior capacidade de inibir ambos os enzimas em estudo e de reduzir o radical DPPH, mesmo apresentando uma menor quantidade de fenóis. Por último, observou-se o perfil de cada um dos extratos obtido através da análise por HPLC-DAD, de forma a tentar entender as diferenças de atividades, sendo que não foram encontradas diferenças significativas que justificassem os resultados obtidos. Deste modo, pode concluir-se que a qualidade dos compostos extraídos da alga cozida seriam superiores, explicando as melhores atividades. O próximo passo consistiu em estudar que modificações ocorreriam nas algas quando sujeitas à digestão no nosso organismo. Para tal realizou-se uma digestão in vitro com suco gástrico e suco pancreático da alga liofilizada, retirando-se alíquotas às 0 e 4 horas, sendo também feita uma digestão de 24 horas para saber se era possível a extração de novos compostos (de um ponto de vista biotecnológico) e todas estas amostras foram para analisar no HPLC-DAD. Os cromatogramas foram esclarecedores mostrando que após a digestão de 4 horas não há muita alteração aos extratos. No entanto, no caso das 24 horas com suco pancreático (WDig), não só foram extraídos novos compostos como também em maior quantidade aqueles que já se encontravam presentes no extrato antes da digestão. Foram então determinadas as atividades biológicas deste extrato revelando que existe uma maior quantidade de fenóis totais, porém não se traduziu num aumento de bioatividade. Por último, com os extratos que obtiveram melhores resultados, nomeadamente o da alga cozida durante 30 minutos e o da digestão de 24 horas com suco pancreático, realizou-se o LC-MS/MS com a finalidade de tentar identificar quais os compostos responsáveis pelas diferenças de atividades. Adicionalmente, para se tentar ver algumas diferenças morfológicas dos diferentes extratos, fez-se a microscopia eletrónica de varrimento. Fechando o capítulo das bioatividades, passou-se ao estudo de U. pinnatifida com células cancerígenas do cólon (Caco-2) e com células cancerígenas do fígado (Hep-G2). Primeiramente, nas células Caco-2 foi medida a citotoxicidade dos extratos W100 e W24, com e sem mucilagens, nas concentrações de 0,1 e 0,5 mg/mL. Não foi revelada nenhuma atividade citotóxica nestas concentrações. Efetuou-se também a eletroforese bidimensional para observar as mudanças do perfil proteico, tendo-se estudado o extrato da alga liofilizada, W100 e WDig. Por último, mediu-se novamente a citotoxicidade nas células Hep-G2 dos extratos W100 e WDig, nas concentrações de 0,1; 0,2 e 0,5 mg/mL. O extrato WDig foi mais citotóxico que W100, com os respetivos valores de IC50 de 0,93 e 1,96 mg/mL. Por fim, efetuou-se uma eletroforese unidimensional para se entender também se existem modificações nos perfis proteicos das células quando em contacto com as amostras em estudo.In recent years there´s been a growing search for a healthy lifestyle and a big part of it comes from diet. As such, in this area several foods are being looked into for their compounds and related health benefits, namely algae. These have been studied because of their antioxidant and anti-obesity activities and it is with that goal in mind that this experimental work took place, focusing on the study of Undaria pinnatifida. This work started with lyophilizing the algae in order to obtain the initial material. With this lyophilized algae decoctions were made, obtaining aqueous extracts. Two initial decoctions were done. One during 24 hours under agitation at room temperature (W24) and one cooked for 30 minutes (W100). To both mucilage precipitation was made with the objective of obtaining a supernatant comprised with a majority of phenolic compounds getting a total of four extracts: cooked algae for 30 minutes, with and without mucilage, and algae 24 hours under agitation at room temperature, also with and without mucilage. Initially, the biological activities of all four extracts were determined, namely total phenol quantification, DPPH radical reduction capacity, acetylcholinesterase inhibition and HMGR inhibition. With this trials we came to the conclusion that the best extract was the cooked algae for 30 minutes since it had the highest inhibition of both acetylcholinesterase and HMGR, as well as highest DPPH reduction capacity with a lower total phenol quantity. Lastly, through HPLC-DAD analysis we observed the obtained profile of each extracts to try to comprehend the difference in activities. However no significant differences were found that justified the results. Consequently, the conclusion to take was that the quality of the compounds extracted from the cooked algae was superior, explaining the better bioactivities. The next step was to study what happened to the algae when it was subjected to digestion in our organism. To such extent, digestion with gastric juice and with pancreatic juice of the lyophilized algae was done, taking aliquots at time 0, 4 hours and also 24 hours digestion was made to see if we could extract new compounds (from a biotechnological standpoint) and all were analysed by HPLC-DAD. The chromatograms were enlightening showing that after 4 hours digestion not much alterations occurred. However in the case of the 24 hours digestion with pancreatic juice (WDig), not only new compounds were extracted but also at larger quantity. The biological activities of this extract were then determined which pointed out an existing larger quantity of total phenols, yet it didn´t manifest in an increase of bioactivity. Finally, with the extracts that had the better results, namely the cooked algae and the digested 24 hours with pancreatic juice, LC-MS/MS was done with the intent of identifying which compounds were responsible for the differences in bioactivities. Additionally scanning electron microscopy was made of the different extracts to see if we could spot some morphological changes. Closing the chapter of the biological activities we moved on to the study of U. pinnatifida with Caco-2 cells, which are colon carcinogenic cells that simulate the intestinal barrier, and with Hep-G2 cells, which are liver carcinogenic cells since this organ has a strong impact in the body´s bioactivities. Firstly, the cytotoxicity of the W100 and W24 extracts, with and without mucilage, was measured in the Caco-2 cells with the concentrations of 0,1 and 0,5 mg/mL. No cytotoxic activity was revealed at either concentration. We also did bidimensional electrophoresis to observe the change of the protein profile, having studied the lyophilized algae, W100 and WDig. Moreover, we again measured the cytotoxicity in Hep-G2 cells of the W100 and WDig extracts at 0,1; 0,2 and 0,5 mg/mL concentrations. WDig was more cytotoxic than W100, with respective IC50 values of 0,93 and 1,96 mg/mL. Lastly, another electrophoresis was done, this time one dimensional, to also better understand the differences in the protein profiles
