Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Biofísica Médica e Fisiologia de Sistemas) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017Viruses are major pathogenic agents that can cause a variety of serious diseases. Indeed, the establishment of cell culture techniques and recombinant virus manipulation contributed for the development of viral-based biotherapies, like gene therapy or vaccines, which require accurate and fast quantification of virus. Despite the numerous titration methods existing nowadays, the majority of them are not able to provide a robust and fast quantification, essential for their clinical application. Moreover, most of them provide indirect measurements of infectious particles, over-estimating virus infectivity, and some rely on virus modification, e.g. by making use of reporter genes (labelled-viruses), which are not allowed when using those virus for clinical applications. As so, the development of a new system capable to cope these drawbacks is of paramount importance for research, diagnostics and industry. In this work, genetically encoded switch-on fluorescent mammalian cell-based assays for detection and quantification of label-free Adenoviruses, using the adenoviral protease (Adenain) as a trigger of the sensor, were developed. Three different main strategies were designed based on structural distortion of a fluorescent protein (GFP – Green Fluorescent Protein), preventing fluorescence emission: GFP VISENSOR (cGFP), Embedded Split-GFP VISENSOR (eS11) and Circular Split-GFP VISENSOR (cS11). Upon Adenain proteolytic processing, structural distortion is relieved and fluorescence emission is reconstituted. VISENSORS performance was assessed by optimizing the best combination of backbone structure and cleavage site, initially by a transient screening and later confirmed on a more biological context, where cells stably expressing the sensor were infected by human Adenovirus serotype 5. Despite eS11 and cGFP displaying similar signal to noise ratio (SNR) performances, cS11 strategy seems the most promising, reaching a signal to noise ratio of 3.12 at 72 hours post-infection. Virus detection was accomplished as soon as 24 hours post-infection in all strategies. Moreover, this work validated the use of VISENSORS as an Adenain dependent sensor and specific for Adenovirus. An attempt to reach maximum distortion and improving SNR performances, a parallel strategy was implemented by structurally distorting both split-GFP fragments. However, the results were not promising. A detailed characterization of the best strategy will be performed as future work, using cell clones stably expressing the sensor to assess VISENSORS’ applicability to Adenovirus quantification. VISENSORS show great potential to deliver a fast, reliable and accurate method for virus and viral vector detection and quantification, much needed not only in the development of viral based-biotherapies, but also for diagnostic and clinical applications.Os vírus constituem um dos principais agentes patogénicos responsáveis por uma grande variedade de doenças graves. O estabelecimento de técnicas de cultura de células e a manipulação génica de vírus contribuíram decisivamente para o desenvolvimento de bioterapias baseadas em partículas virais, como a terapia génica ou a vacinação, que requerem uma quantificação precisa e rápida da carga viral. Apesar dos inúmeros métodos de titulação existentes hoje em dia, a sua maioria não é capaz de fornecer uma quantificação robusta e rápida, essencial para sua aplicação clínica. Além disso apresentam uma série de desvantagens, tais como o facto de na sua maioria fornecerem medidas indiretas do número de partículas infeciosas, sobrestimando a infecciosidade do vírus; são morosos e com reduzido potencial de processamento rápido; outros dependem de modificação génica, envolvendo por exemplo o uso de genes repórter (vírus com marcação), o que não é permitido em aplicações clínicas. Como tal, os biossensores virais representam uma excelente alternativa aos métodos de titulação tradicionais, sendo amplamente utilizados em biomedicina no diagnóstico de doenças infeciosas e desenvolvimento de medicamentos. De todos os biossensores existentes, os sensores baseados em células constituem como uma das estratégias mais promissoras, devido à capacidade das células em responder às mudanças ambientais externas de forma rápida e precisa. Tomando partido das células como elementos de deteção, torna-se possível o desenvolvimento de sensores de elevada especificidade e sensibilidade a um grande número de agentes externos, como os vírus, fornecendo assim uma medida direta da sua infecciosidade. Na construção de um biossensor, para além do detetor é também necessário um transdutor do sinal. Para tal, a fluorescência é amplamente usada como transdutor devido à sua alta sensibilidade e seletividade, suficiente resolução espaço-tempo e baixo custo. Assim, e tendo em conta a necessidade de desenvolver um novo sistema capaz de lidar com as desvantagens apresentadas pelos métodos de titulação atuais, uma estratégia que tire partido de proteínas fluorescentes associadas a células para deteção e quantificação de vírus sem marcação revela-se extremamente promissora. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um biossensor de fluorescência para deteção e quantificação de vírus sem marcação (de acrónimo VISENSORS), tomando partido da protease viral, componente responsável pela maturação e processamento das proteínas virais, como ativador do sensor. Como modelo de estudo, e para prova de conceito, foram usados Adenovírus devido à sua importância no desenvolvimento de vacinas e uso como vetor viral em aplicações de terapia génica. Três estratégias de biossensores foram implementadas tendo por base a distorção estrutural de uma proteína fluorescente, a GFP, incapacitando-a de emitir fluorescência até que seja aliviada a distorção pela protease adenoviral. A primeira estratégia (denominada Circular VISENSOR, cGFP) consiste na circularização da superfolder-GFP, tomando partido da singular característica das inteínas (porções de proteína) de se libertarem, fundindo os segmentos a qual se encontravam ligadas. Na tentativa de alcançar máxima distorção para um melhor desempenho do sensor, duas outras estratégias foram desenvolvidas tendo por base a transcomplementação da split-GFP, criando distorção estrutural apenas ao nível do fragmento S11 da GFP. Desta forma, a segunda estratégia (denominada Embedded split-GFP, eS11) consistiu na inserção do fragmento S11 no loop de uma pequena proteína. Por sua vez, a terceira estratégia (denominada Circular split-GFP, cS11) consistiu na circularização do fragmento S11, mediada por inteínas, de forma semelhante à cGFP. A fluorescência é reconstituída quando a protease reconhece uma sequência especifica de corte e, por consequência, alivia a distorção estrutural permitindo a transcomplementação dos fragmentos de GFP e a emissão de fluorescência. A aplicação de diferentes distorções estruturais no biossensor pode alterar o seu desempenho quer ao nível da emissão de fluorescência quando não ativado ou após a sua ativação. Assim, para avaliar o desempenho do sensor começou por se otimizar a melhor combinação de estrutura de sensor e local de clivagem, primeiramente de forma transiente e posteriormente confirmando num contexto mais biológico, infetando com adenovírus células que expressam de forma estável os sensores. Os resultados obtidos confirmaram esta hipótese. Através da adição de glicinas (aminoácido de pequenas dimensões e elevada flexibilidade) verificou-se um aumento da emissão de fluorescência em todas as estratégias, possivelmente provocado por relaxamento da distorção estrutural. Por outro lado, a utilização de sequências de clivagem constituídas na sua maioria por aminoácidos mais hidrofóbicos demonstraram uma diminuição de fluorescência, contrariamente às sequências que possuem na sua constituição aminoácidos maioritariamente hidrofílicos. Sugere-se assim que as diferentes hidrofilicidades das sequências de corte podem ter um impacto ao nível da eficiência de clivagem por parte da protease adenoviral e/ou da correta maturação do cromóforo da proteína fluorescente. Surpreendentemente, em todas as estratégias, foi observado uma diminuição da emissão de fluorescência por parte das células não infetadas ao longo do tempo, o que pode dever-se ao fato das células não infetadas atingirem a fase estacionária (ao contrário de células infetadas cujo ciclo celular é interrompido) em que a expressão de proteína (tal como o sensor) diminui e, consequentemente, a emissão de fluorescência também diminui. Assim, para a performance Sinal/Ruído por parte de cada sensor é de se considerar não só uma contribuição do aumento de emissão de fluorescência devido à ativação do sensor pela protease adenoviral (Sinal), mas também uma contribuição da diminuição da fluorescência por parte das células não infetadas que são usadas como controlo negativo (Ruído). Comparando as três estratégias desenvolvidas, eS11 e cGFP demonstraram possuir desempenhos semelhantes ao nível da razão Sinal/Ruído, enquanto que a estratégia cS11 parece ser a mais promissora, atingindo uma razão Sinal/Ruído de 3.12 às 72 horas após a infeção. Adicionalmente, demonstrou-se que o sensor é especifico, sendo apenas ativado na presença da protease de Adenovírus e não de outras proteases virais. Para além das três estratégias principais, foi desenvolvida em paralelo uma nova abordagem baseada na distorção estrutural de ambos os fragmentos da split-GFP. Esta foi alcançada através da circularização do fragmento S10 da GFP (cGFPS10) em combinação com as distorções realizadas nas estratégias eS11 e cS11. Os resultados obtidos, no entanto, não se mostraram promissores em parte devido à incompatibilidade das estratégias usadas. Por exemplo, a circularização dos fragmentos S11 e S10 da GFP (cS11 e cGFPS10) apresentou uma razão Sinal/Ruído menor do que a distorção apenas do fragmento S11 (cS11). Este fenómeno poderá ser explicado pelo uso em ambos os processos de circularização do mesmo tipo de inteínas, não evitando assim a trans-circularização de S11 e S10 e a formação de uma GFP funcional, sem ser necessária a ativação por parte da protease viral. Este trabalho foi pioneiro na implementação em células de mamíferos de estratégias baseadas em distorção estrutural de proteínas fluorescentes como biossensores para a deteção e quantificação de Adenovírus sem marcação. Durante esta tese de mestrado foram implementadas, com sucesso, três diferentes estratégias para deteção de Adenovírus. A melhor das estratégias, a cS11, será agora alvo de uma caracterização detalhada, usando clones celulares a expressarem de forma estável o sensor por forma a validar as otimizações realizadas e a avaliar a sua aplicabilidade como método de quantificação de Adenovírus. Os VISENSORS demonstram assim grande potencial tendo em vista o desenvolvimento de um método rápido, fiável e específico para a deteção e quantificação de vírus e vetores virais sem marcação, bem como uma enorme aplicabilidade não só no estudo e desenvolvimento de bioterapias baseadas em vírus, mas também com aplicações clínicas e em diagnóstico
