Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017As lesões da espinal medula afectam actualmente milhões de pessoas em todo o mundo, que se deparam com um agravamento radical da sua qualidade de vida que, na maioria dos casos, não poderá ser recuperada. A Organização Mundial de Saúde define “lesão da espinal medula” como a perda total ou parcial de função neural provocada por um trauma ou uma patologia da espinal medula, resultando na diminuição do controlo motor abaixo do local da lesão assim como na perda de sensibilidade e regulação do sistema nervoso autónomo. A resposta clínica padrão actual tem como objectivo apenas tentar impedir o alastramento da lesão e consiste na realização de cirurgias para estabilizar a estrutura da coluna vertebral e descomprimir o local da lesão, seguidas de tratamento com metilprednisolona. No entanto, dado que o ambiente da lesão em mamíferos é extremamente inibitório para a ocorrência de regeneração, novos estudos têm tentado obter soluções terapêuticas que actuem na promoção de um ambiente pró-regenerativo, assim como na protecção dos tecidos que permanecerem intactos e funcionais após a lesão. A maior parte destas novas terapêuticas tem como objectivo prevenir o aparecimento de fenómenos associados à chamada lesão secundária ou de mitigar o seu efeito, dado que estes são em grande parte responsáveis pelo grau da lesão a longo prazo.
Ao contrário do que se considerou durante décadas, investigações dos últimos 20 anos têm demonstrado que existem determinadas áreas no sistema nervoso central em que ocorre a formação de novos neurónios durante a vida adulta. Verificou-se também que existem células com capacidades estaminais neurais nestas e noutras zonas do sistema nervoso central, o que sugere que algumas células no adulto poderão ser estimuladas a originar novos neurónios e glia após uma lesão. As células ciliadas que revestem o interior do canal central na espinal medula, designadas células ependimárias, são um exemplo disso. Vários estudos observaram que estas células ependimárias respondem a uma lesão na espinal medula através da proliferação e migração para o local da lesão, onde originam astrócitos e oligodendrócitos; no entanto, são também capazes de originar neurónios quando cultivadas in vitro. O seu perfil de expressão inclui vários marcadores associados a células estaminais neurais, apoiando observações que indicam estas células como as únicas a possuir capacidades multipotentes no nicho do canal central. Pelo facto de serem as únicas células multiciliadas no canal central, as células ependimárias de mamífero podem ser identificadas pela expressão do factor de transcrição Foxj1, conhecido pelo seu papel como regulador da ciliogénese.
O peixe-zebra (Danio rerio) já é conhecido como modelo em biologia do desenvolvimento há mais de 30 anos, mas a sua utilização para o estudo da regeneração de tecidos e órgãos é bastante mais recente. As extraordinárias capacidades de regeneração deste organismo, aliadas à bateria de métodos genéticos e moleculares desenvolvidos e adaptados para este modelo, tornaram o peixe-zebra num aliado inestimável para entender processos regenerativos e compará-los com a situação dos mamíferos, cujas capacidades regenerativas são muito inferiores. As características biológicas do peixe-zebra são particularmente apelativas, por exemplo para geração de linhas transgénicas: são capazes de gerar um grande número de embriões – transparentes, que permitem a observação de fenótipos relativamente cedo – e atingem a maturidade aos 3 meses, acelerando o processo de geração da linha. Os métodos desenvolvidos para a geração de peixes transgénicos também têm demonstrado elevados níveis de sucesso, especialmente o sistema Tol2, que se baseia na injecção do DNA desejado juntamente com mRNA que codifica para uma transposase; esta reconhece sequências específicas que flanqueiam o DNA injectado e insere-o no genoma do embrião. Entre as várias estruturas que o peixe-zebra consegue regenerar encontra-se a espinal medula, que obtém uma recuperação funcional quase completa um mês após a lesão. Este resultado deve-se tanto ao crescimento de axónios seccionados como à formação de novos neurónios no local da lesão, mecanismos promovidos por um ambiente pró-regenerativo. Os novos neurónios e células da glia são produzidos por células que revestem o canal central da espinal medula, tendo por isso função de epêndima, mas que também apresentam outras características morfológicas reminiscentes das células da glia radial, progenitores neurais durante o desenvolvimento (tanto em peixe-zebra como em mamífero). A utilização de marcadores moleculares para identificação destas células tem sido controversa, mas existe um marcador que poderá ser utilizado de forma clara. Devido à sua função ependimária, estas células possuem cílios e expressam por isso o factor de transcrição Foxj1a, um dos ortólogos do Foxj1 de mamífero. Será por isso importante desenvolver ferramentas que permitam estudar o papel que as células foxj1a+ da espinal medula do peixe-zebra desempenham após uma lesão, que pode ser realizado através da identificação da sua descendência (experiência de lineage tracing) e da sua função real no contexto de uma lesão promovendo a sua ablação específica. Este trabalho apresentava assim como objectivo principal o estabelecimento de linhas transgénicas estáveis em peixe-zebra que permitissem efectuar de forma eficaz e separadamente: 1) a marcação permanente das células foxj1a+ e da sua descendência; 2) a ablação específica das células foxj1a+, em ambos os casos após uma lesão da espinal medula.
Para a geração da linha para lineage tracing foram testados três constructs separadamente, mas apenas com um deles foi possível observar passagem evidente do transgene para embriões F1. Ainda assim, o sucesso desta transgénese foi inferior ao reportado para o método utilizado. Os outros dois constructs apresentaram percentagens muito baixas de embriões positivos e de níveis de expressão dos transgenes após injecção, mesmo depois de tentativas de optimização, e de todos os que cresceram até atingir maturidade não foram detectados peixes fundadores de forma inequívoca. Para a geração da linha para ablação das células foxj1a+ foram testados dois constructs com os quais não foi possível obter um número suficiente de embriões positivos para crescer. O primeiro foi abandonado quando se observou que várias características do plasmídeo em que estava inserido não seriam adequadas para manter um nível de expressão adequado à experiência, como a falta da sequência Kozak e do sinal de poliadenilação a flanquear a sequência codificante. O segundo foi desenhado de forma a optimizar todas as sequências para promover uma expressão eficiente do transgene, contendo sequências de reconhecimento da transposase e sequências regulatórias a 5’ e 3’ da sequência codificante vindas de um plasmídeo utilizado como controlo positivo para as injecções, assim como a sequência codificante de uma proteína fluorescente (como repórter) que apresentara bons níveis de expressão com o promotor foxj1a. Não obstante, este construct parece não ter sido integrado no genoma dos embriões em que foi injectado dado que praticamente toda a expressão observada às 24 horas-pós-fertilização tinha sido perdida 4 dias depois. As razões que levaram ao insucesso na obtenção de embriões positivos após a injecção são desconhecidas para a maioria dos constructs testados, mas poderão estar relacionadas com mutações não detectadas nas regiões regulatórias ou nas sequências de reconhecimento da transposase, que impediriam a correcta expressão do construct ou a sua inserção no genoma, respectivamente.
A experiência de lineage tracing concebida baseia-se na utilização do sistema de recombinação CreERT2/LoxP, que utiliza uma versão modificada da enzima Cre a que foi acrescentado um receptor de estrogénio. Esta modificação adiciona um passo de controlo temporal à experiência visto que é necessário activar a CreERT2 com administração da droga 4-OHT para que a enzima possa efectuar a recombinação entre locais LoxP e assim promover a marcação de células foxj1a+. O segundo objectivo deste trabalho foi então a optimização do protocolo de activação da CreERT2, que foi conseguido pela primeira vez neste laboratório. Inicialmente foram utilizados embriões que expressavam a CreERT2 e a cassete repórter na maioria das células (expressão induzida pelo promotor de uma proteína heat shock), tendo-se verificado que a eficácia da recombinação foi directamente influenciada pela concentração de 4-OHT administrada. A remoção do córion dos embriões por adição de pronase também promoveu este efeito ao permitir um acesso mais rápido da droga aos tecidos. Embriões e larvas F1 dos fundadores obtidos com a injecção de um dos constructs para lineage tracing foram também utilizados para testar a activação da CreERT2, mas neste caso não se observou a ocorrência de recombinação em células foxj1a+, mesmo após a sua proliferação ter sido induzida através da realização de uma lesão na espinal medula.
Devido ao insucesso em gerar linhas transgénicas funcionais neste trabalho, será necessário utilizar novos métodos e/ou novos constructs para obter ferramentas biológicas que permitam no futuro compreender a função das células foxj1a+ durante a regeneração da espinal medula no peixe-zebra.Spinal cord injury (SCI) is a disabling condition affecting millions of people worldwide. In order to improve functional recovery, new therapies are being devised to counteract the non-regenerative environment of the mammalian spinal cord. Ependymal cells (EC) of the spinal cord central canal have been proven to hold neural stem cell properties in vitro, suggesting that a pro-neurogenic fate could potentially be promoted in vivo after a lesion. The zebrafish Danio rerio has proved a valuable tool for developmental studies and, in recent years, for regenerative processes due to its remarkable ability to regenerate several organs and tissues. After SCI new neurons and glia are generated by the cells lining the central canal, which hold a strong resemblance to mammalian EC. Both mammalian and zebrafish EC have in common the expression of the transcription factor responsible for cilia formation: Foxj1/Foxj1a. However, no study has been performed to discover the progeny of zebrafish foxj1a+ cells after a lesion or their functional role in regeneration. This work aimed at generating stable transgenic zebrafish lines that allowed the investigation of foxj1a+ ependymal cell progeny after SCI, using lineage tracing, and also their specific ablation with a suicide gene.
A total of three constructs for lineage tracing lines and two constructs for cell ablation lines was injected with transposase mRNA into one-cell stage embryos but only one of the lineage tracing constructs resulted in clear germline transmission to F1 embryos. All the other four constructs proved very difficult to generate stable expression in injected embryos as well as an adequate number of positives, even after several optimization attempts. Reasons for this lack of transgenesis efficiency are not completely understood but may include inadequate coding sequence features, undetected problems in untranslated regions, or obstacles to transposition such as mutations in transposase recognition sequences.
Since the lineage tracing is based on the CreERT2/LoxP technology, optimization of CreERT2 activation was also performed. It was found that recombination efficiency is directly influenced by 4-OHT concentration and enhanced by treatment with pronase. However, when using a lineage tracing line no recombination was detected in foxj1a+ cells even after induced proliferation, prompting the need to validate CreERT2 function in this line
