Hell, Stefan W.

German

Dokumentenserver der Akademie der Wissenschaften zu Göttingen

Stefan W. HellFluoreszenzmikroskopie in ungekannter Schärfe(Vortrag in der Plenarsitzung am 25. Mai 2007)Nach dem Abitur in Ludwigshafenam Rhein im Jahre 1981 studier-te ich Physik in Heidelberg undkam gegen Ende meiner Promotion(1990) zu der Ansicht, daß sich Ab-bes Beugungsgrenze im Fernfeldmi-kroskop überwinden ließe – woraufich mich im Anschluß diesem Pro-blem verschrieb. Nach kurzer Zeitals freier Erfinder forschte ich fürzwei Jahre am Europäischen Mole-kularlaboratorium und, von einemhalbjährigen Aufenthalt in Oxfordabgesehen, fast vier Jahre an der Uni-versität Turku in Finnland. 1997kam ich als Leiter einer selbstän-digen Nachwuchsgruppe ans MPIfür Biophysikalische Chemie, wo ich2002 zum wissenschaftlichen Mit-glied und Leiter einer Abteilung be-rufen wurde.Stefan W. Hell, Direktor am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie inGöttingen, O. Mitglied der GöttingerAkademie seit 2007„Ein Bild sagt mehr als tausend Worte . . . “ – das gilt nicht nur im Alltag,sondern auch in der Wissenschaft. Es ist daher nicht überraschend, daß dasLichtmikroskop wie kaum ein anderes Instrument zum Symbol wissen-schaftlicher Forschung wurde. Doch die herkömmliche Lichtmikroskopiesteht vor einem grundsätzlichen Problem, das 1873 von Ernst Abbe be-schrieben wurde: Beugung verhindert die Trennung von Details, die in derFokalebene (x , y) weniger als d = λ/2n sinα voneinander entfernt sind,denn Licht breitet sich als Welle aus und wird gebeugt, und das Beugungs-hauptmaximum in der Brennebene des Objektivs kann im Durchmessernicht schärfer als d sein. Dabei bezeichnet λ die Lichtwellenlänge, n den414 Stefan W. HellBrechungsindex und α den halben Öffnungswinkel des Lichtkegels. Da λfür sichtbares Licht zwischen 400 nm and 700 nm rangiert, schien es un-möglich, Objekte die feiner als 200 nm sind, mit sich frei ausbreitendenLichtwellen abzubilden.Abbes Beugungsgrenze veranlaßte die Erfindung des Elektronenmikro-skops, das aufgrund seiner 10–10000maligen Auflösung enorm zum wissen-schaftlich-technischen Fortschritt beigetragen hat. Doch die Abkehr vomLicht führte zu anderen Einschränkungen. Elektronstrahlen können nur einpaar Mikrometer in die Probe vordringen, was die Abbildung auf Ober-flächen oder dünne Proben beschränkt; lebende Zellen lassen sich damitsowieso nicht betrachten. Die Rastertunnel- und die Rasterkraftmikro-skopie haben fraglos eine neue Welt erschlossen, aber auch sie sind aufOberflächen begrenzt. Letzteres gilt auch für ihr optisches Pendant, dasRaster-Nahfeldmikroskop, das mit einer feinen Spitze die Licht-Objekt-Wechselwirkung auf einen Bruchteil von λ einengt [1]. Das Abrastern ei-ner – lebenden – Zelle läßt sich damit kaum bewerkstelligen und läßt sicherst recht nichts bewerkstelligen in ihrem Inneren. Eine Lösung wäre, sehrkurze Wellenlängen zu verwenden: die Röntgenmikroskopie (λ= 2–5 nm)liefert heute Auflösungen von∼ 30 nm in der Fokalebene [2]. Doch Rönt-genlicht ist schwer zu fokussieren, und die erste Belichtung einer Zelle führtzum Stillstand. Damit liegt auf der Hand: Hochauflösendes 3D-Abbildenvon intakten oder sogar lebenden Zellen geht nur mit fokussiertem Licht.Die Fluoreszenzmikroskopie spielt dabei eine herausragende Rolle, dennheftet man ein Markermolekül an die interessierenden Zellbestandteile an,so läßt sich dieses anhand der Markerfluoreszenz erkennen. Man kannsogar die Zelle genetisch dazu bringen, ihre eigenen Marker zu produzie-ren. Vergleichbare Möglichkeiten gibt es in keinem anderen Mikroskopie-verfahren. Es ist daher nicht überraschend, daß ca. 80 % aller Mikrosko-pieaufnahmen der Lebenswissenschaften im Fluoreszenzkontrast durchge-führt werden. Die Überwindung der Beugungsgrenze in einem „Fernfeld“-Fluoreszenzmikroskop ist daher nicht nur physikalisch spannend, sondernauch von eminenter praktischer Bedeutung.Ich werde nun berichten, daß man die Beugungsgrenze im Fluoreszenz-mikroskop aufheben kann, ohne die Beugung selbst aufheben zu müssen.Der Schlüssel hierfür ist die Einbeziehung der Zustände des Markermole-küls in die Bildentstehung. In der Tat liefen bisher alle fernfeldoptischen„nanoskopischen“ Verfahren darauf hinaus, die Markermoleküle transientzwischen einem fluoreszierenden (hellen) Zustand A und einem dunklenZustand B oder umgekehrt zu überführen, und zwar so, daß der räumlicheBereich (zumeist) des hellen Zustands A auf* λ/2 eingeengt wird [3–5].Fluoreszenzmikroskopie in ungekannter Schärfe 415Abbildung 1: (a) Vereinfachtes Energieschema (Jablonski-Diagramm) eines fluoreszen-ten organischen Moleküls und die wichtigsten Übergänge. (b) Die Fluoreszenz (oder dieBesetzung des S1) nimmt fast exponentiell mit der Intensität des stimulierenden StrahlsI ab. Die Rate der stimulierten Emission ist durch Iσ/(h̄ω) gegeben, wobei σ den mo-lekularen Wirkungsquerschnitt und h̄ω die Photonenenergie bezeichnet. Bei der „Sätti-gungsintensität“ Is = h̄ω/(τfl σ) hat die Fluoreszenz zur Hälfte abgenommen, wobei τfldie Lebensdauer des S1 bezeichnet.Die Bilderfassung erfolgt dabei durch zeitlich sequentielles Auslesen diesertransient geschaffenen ultrascharfen (hellen) Bereiche. Weil sich mehreregeeignete Hell-Dunkel-Paare A, B in Markermolekülen finden lassen, istdieser Ansatz erstaunlich generell und im Grunde genommen auch nichtauf Fluoreszenz beschränkt [5,6].Wie läßt sich ein Molekülzustand A mit frei laufenden Lichtwellen aufBruchteile von λ eingrenzen? Das erste Verfahren, mit dem dies gelun-gen ist, ist die Stimulated Emission Depletion (sted)-Mikroskopie [3]. Inseiner einfachsten Ausführung verwendet ein rasterndes sted-Mikroskopeinen fokussierten Laserstrahl, der den Fluoreszenzmarker durch die Ab-sorption eines Photons aus dem Grundzustand S0 in den fluoreszentenelektronischen Zustand S1 anregt (Fig. 1). Das angeregte Molekül emittiertinnert τfl ≈ 3 ns ein Photon einer längeren Wellenlänge und kehrt in denS0 zurück (Fig. 1). Der S1 ist somit der helle Zustand A, und der Grundzu-stand S0 ist sein dunkles Pendant B. Doch alle Moleküle, die sich innerhalbder Beugungsscheibe mit Durchmesser d = 200–350 nm befinden, kön-nen in den S1 angeregt werden. Im sted-Mikroskop (Fig. 2) wird nundie effektive Anregung in den S1 räumlich eingeschränkt. Dazu verwendetman einen zweiten, „doughnut“-förmigen Strahl mit einer mittigen Null-stelle, der über die Beugungsscheibe gelegt wird. Die Wellenlänge dieses„sted-Strahls“ ist so stark rotverschoben, daß seine Photonenenergie nichtausreichen würde, um Moleküle anzuregen, aber genau paßt, um angeregteMoleküle durch stimulierte Emission abzuregen. Der Doughnut sorgt da-416 Stefan W. HellAbbildung 2: In einem typischen sted-Mikroskop werden das Anregungslicht unddas Abregungslicht für die stimulierte Emission (sted-Strahl) gleichzeitig in das Mi-kroskopobjektiv eingekoppelt: (a) Während der Anregungsstrahl einen Beugungsfleckvon > 250 nm im Durchmesser hervorbringt, wird der sted-Strahl so modifiziert, daßer im Fokalbereich einen Doughnut ausbildet. (b) Im Randbereich des Anregungs-Spotswird die Fluoreszenz verhindert (I $ Is), während sie in der Nullstelle des Doughnuts(I = 0) erhalten bleibt. Der Bereich, in dem die Fluoreszenz noch möglich ist, wird auf-grund des nahezu exponentiellen Abbaus des S1 (Fig. 1b) mit zunehmend intensiveremsted-Strahl immer weiter eingeschnürt (b) – prinzipiell bis auf ein Molekül, was bedeutet,daß es mit Hilfe der sted-Mikroskopie prinzipiell möglich ist, molekulare Auflösung mitfokussiertem Licht zu erhalten.für, daß ein Molekül, das im Außenbereich der Beugungsscheibe angeregtwurde, abgeregt und damit effektiv im S0 – also im dunklen Zustand B –gehalten wird. Damit können nur Moleküle aus dem Doughnut-Minimumausreichend im S1 (also in A) verweilen.Anregung und Abregung lassen sich gut mit synchronisierten Lichtpul-sen von < 100 ps bzw. > 300 ps bewerkstelligen [3]. Die Energie des ehemalsangeregten Moleküls wird größtenteils als ein weiteres Photon des sted-Strahls mitgeführt, der spektral scharf und gerichtet ist, so daß man ihnleicht von der breit und ungerichtet emittierten Fluoreszenz trennen kann.Nun liegt auf der Hand: Je enger das Minimum des Doughnuts, desto schär-fer ist der S1 eingeengt, d. h., desto schärfer wird der Fluoreszenz-Spot, derdie Auflösung bestimmt (Fig. 2). Doch auch der Doughnut unterliegt derBeugungsgrenze, und seine Halbwertsbreite (fwhm) kann nicht ohne weite-res∼ 150 nm unterschreiten. Um den S1 noch stärker einzugrenzen, nutztdie sted-Mikroskopie nun den Umstand, daß die Besetzung des S1 nahezuexponentiell mit der Intensität I des sted-Strahls abnimmt (Fig. 1b) [7]. Issei hier als der „Schwellwert“ definiert, bei dem die Besetzung des S1 halbiertist, und I ist die Intensität des Doughnuts. Für I ≤ Is ist die EingrenzungFluoreszenzmikroskopie in ungekannter Schärfe 417gering, falls jedoch I # Is , so ist der runde Fleck, in dem die Fluoreszenzzugelassen ist, deutlich kleiner, weil dann ein größerer Teil des Doughnutsweit über Is liegt und so den S1 unterdrückt. Damit drängt die Fluoreszenz-verhinderung immer stärker an die Nullstelle heran, und der Spot, in demdie Fluoreszenz noch zugelassen ist, wird immer kleiner (Fig. 2). Doch ganzgleich, wie hoch I auch ist, an der Nullstelle (I = 0) kann ein Molekülimmer fluoreszieren, denn dort gibt es keine Abregung. Rastert man dieNullstelle durch die Probe, dann liefert das punktweise gemessene und ineinem Rechner aufgetragene Signal automatisch Strukturen unterhalb derBeugungsgrenze, denn eng benachbarte Punkte werden jetzt hintereinan-der erfaßt. Das gemeinsame Rastern der Anrege- und der Abregestrahlenläßt sich mit Strahlrastertechniken durchführen, etwa durch Ablenken miteinem beweglichen Spiegel. Einfache Rechnungen zeigen [4, 6, 8], daß dieAuflösung einem neuen Gesetz folgt:d =λ2n sinα√1 + I/IsIs ist charakteristisch für das verwendete Fluoreszenzmolekül und die Wel-lenlänge für sted. Die Auflösung nimmt mit der Intensität I des sted-Strahls zu. Läßt man ihn weg (I = 0), so erhält man Abbes Formel.Das grundsätzlich Neue an dem sted-Konzept ist aber, daß man durchI/Is →∞ prinzipiell d → 0 erzielen kann, d. h., die Auflösung ist grund-sätzlich bis auf Molekülgröße steigerbar, obwohl alle Strahlen gebeugt sind.Die Beugungsgrenze ist also nicht „verschoben“, sondern „aufgehoben“.Daß es sich dabei aber um ein Fernfeldmikroskop handelt, zeigt sich darin,daß die Auflösung d mit λ skaliert. Das Wurzelverhalten rührt letztlichdaher, daß der Intensitätsverlauf an der Nullstelle in erster Näherung para-bolisch ist.Kombiniert mit einem konfokalen Mikroskop, behält das sted-Mikro-skop die Vorteile des ersteren bei. Es ist 3D-fähig und funktioniert unternormalen Umgebungsbedingungen. Anwendungen finden sich sowohl inder Zellbiologie [9] als auch in den Materialwissenschaften [10], sofernFluoreszenzmarkierungen eingesetzt werden können.Das Charakteristikum des sted-Mikroskops ist natürlich nicht derDoughnut an sich, sondern die Lichtverteilung mit einer Nullstelle, wel-che den Übergang S1 → S0 übersättigt, so daß sich der signalgebendeZustand S1 nur an der Nullstelle einstellen kann. Damit ist klar, daß diested-Mikroskopie nur der Modellfall eines viel allgemeineren Konzeptszum Durchbrechen der Beugungsgrenze ist; denn es läuft ja darauf hinaus,einen – signalgebenden – Zustand A mit einer Intensitätsnullstelle räum-418 Stefan W. HellAbbildung 3: Verteilung eines fluoreszenzmarkierten Proteins (snap-25) auf einer Zell-membran. Im Gegensatz zu ihrem konfokalen Pendant löst die sted-Aufnahme (rechts)einzelne Proteincluster mit einer Auflösung von∼ 60 nm auf und erlaubt deren Größen-bestimmung. snap-25 spielt bei der Verschmelzung von synaptischen Vesikeln mit derZellmembran eine wichtige Rolle.lich einzugrenzen und den Marker außerhalb der Nullstelle vorübergehendin einem dunklen Zustand B zu parken. Es muß daher auch andere Hell-Dunkel-Paare A und B geben, die für diese Zwecke geeignet sind [4, 5].Solche Zustände sind zum Beispiel konformationelle Zustände von Mole-külen, bei denen sich die Atome nach Lichtabsorption so umlagern, daßin dem einen Fall Fluoreszenz stattfinden kann und in dem anderen Fallnicht, also cis-trans Photoisomerisationen zwischen einem fluoreszentenund einem nicht-fluoreszenten konformationellen Zustand.Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß alle nanoskopischen Verfah-ren bisher darauf hinausliefen, vorübergehend einen signalgebenden Mar-kerzustand A zu schaffen, der deutlich enger lokalisiert ist als λ/2. Der An-satz, die Zustände des Markers in die Bildentstehung einzubeziehen, warder Schlüssel zum Durchbruch der Beugungsgrenze [3]. Daher stellt sichdie Frage, ob die hier beschriebenen Verfahrengrundsätzlich auf fluoreszen-te Objekte beschränkt sind? Die Antwort lautet: nein, denn die Fluoreszenzdes Zustands A ist keine Voraussetzung für dessen räumliche Einengung.Ein Zustand A, der statt Fluoreszenz jedes andere meßbare Signal aussen-det, würde sich genauso eignen, Abbes Grenze zu durchbrechen; denn dieseSignale zeigen A nur an, um ihn von B abzuheben. Es wäre daher nicht über-raschend, wenn in naher Zukunft auch für andere Kontrastverfahren deroptischen Fernfeldmikroskopie die Beugungsgrenze durchbrochen würde.Heute steht bereits fest, daß sich im Fluoreszenzkontrast Auflösungenvon 15–50 nm realisieren lassen, was unlängst noch der Elektronenmikro-skopie vorbehalten zu sein schien. Die Bedeutung, die diese EntwicklungFluoreszenzmikroskopie in ungekannter Schärfe 419für die Lebenswissenschaften haben wird, beginnt sich erst abzuzeichnen.Um zwei Beispiele zu nennen: sted-Mikroskopie konnte das neuronaleProtein Synaptotagmin aus einzelnen neuronalen Bläschen (Vesikel) erst-mals direkt an der Synapse auflösen und eine Debatte über seine Verteilungbeenden [9], und man konnte herausfinden, wie viele Syntaxin-1-Proteinean der präsynaptischen Membran zusammenfinden müssen, damit Vesi-kel mit ihr verschmelzen können [11]. Führt man sich vor Augen, daßdie meisten Proteininteraktionen der Zelle auf der Skala < 200 nm stattfin-den und daß diese Skala bisher schwer nichtinvasiv zugänglich war, so läßtsich erahnen, daß der fernfeldoptischen „Nanoskopie“ eine Schlüsselrollein den Lebenswissenschaften zukommen wird. Nach allem, was wir heutewissen, ist davon auszugehen, daß binnen fünf Jahren ein optisches „Nano-skop“ zum instrumentellen Standardrepertoire zellbiologischer Forschunggehören wird.Literatur1. D.W. Pohl, W. Denk, M. Lanz, Appl. Phys. Lett. 44, 651 (1984).2. P. Guttmann et al., J. de 104, 85 (2003).3. S.W. Hell, J. Wichmann, Opt. Lett. 19, 780 (1994).4. S.W. Hell, Nature Biotechnol. 21, 1347 (2003).5. S.W. Hell, Science 316, 1153 (May 25, 2007).6. S.W. Hell, Phys. Lett. A 326, 140 (2004).7. M. Dyba, S.W. Hell, Phys. Rev. Lett. 88, 163901 (2002).8. V. Westphal, S.W. Hell, Phys. Rev. Lett. 94, 143903 (2005).9. K.I. Willig, S.O. Rizzoli, V. Westphal, R. Jahn, S.W. Hell, Nature 440, 935 (2006).10. K. Willig, J. Keller, M. Bossi, S.W. Hell, New J. Phys. 8, 106 (2006).11. J.J. Sieber et al., Science 317, 1072 (2007).

Fluoreszenzmikroskopie in ungekannter Schärfe

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Fluoreszenzmikroskopie in ungekannter Schärfe

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