Tese de mestrado integrado, Engenharia Biomédica e Biofísica (Engenharia Clínica e Instrumentação Médica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019O melanoma é um cancro agressivo que pode facilmente ser confundido com nevos benignos quando nas fases iniciais de desenvolvimento. Com um diagnóstico precoce, a lesão pode ser removida cirurgicamente, mas esta camuflagem dificulta esse diagnóstico. Por isso, soluções terapêuticas para tratar melanoma em fases mais avançadas são cruciais para atingir boa qualidade de vida e taxa de sobrevivência do paciente. A terapia standard para tratar melanoma em estadios mais avançados envolve quimioterapia com Dacarbazina, um agente aprovado pela FDA em 1975, mas baixa resposta ao tratamento e taxa de sobrevivência encorajam a investigação de outras opções de tratamento. Alternativas quimioterapêuticas, como um análogo oral da Dacarbazina, ou fármacos metálicos como a cisplatina existem, mas sem se destacarem do tratamento padrão, Dacarbazina. A combinação de agentes quimioterapêuticos pode ajudar na resposta ao tratamento, levando, contudo, a mais efeitos secundários sem melhorar a taxa de sobrevivência. Agentes imunoterapêuticos, que induzem ou fortalecem a resposta imunitária contra células tumorais, como Ipilimumab, Interferão-Alfa, Interleucina-2 e Timosina Alfa 1 obtiveram melhores resultados em termos de resposta e sobrevivência, sendo que Ipilimumab foi aprovado como um tratamento de primeira linha na Europa. Ainda assim, necessitam de monitorização de efeitos secundários para garantir qualidade de vida dos pacientes, o Interferão-Alfa e Interleucina-2 são especialmente tóxicos. Outra alternativa ainda, apelidada de terapia dirigida, ataca os caminhos de sinalização usados pelas células tumorais para crescerem e se replicarem, tendo já alguns tratamentos aprovados com um desempenho superior à Dacarbazina, como Dabrafenib e Cobimetinib. A limitação destes tratamentos reside na resistência ao fármaco que é desenvolvida ao longo do tratamento, impedindo um tratamento extenso com o mesmo agente terapêutico. Finalmente, é possível ainda combinar agentes com ações diferentes, correndo sempre o risco de aumentar a severidade ou quantidade de efeitos secundários sobre o paciente. Qualquer opção terapêutica usada resulta invariavelmente em efeitos secundários, que podem ser minimizados através da construção de um sistema de entrega adequado. Sistemas de entrega de fármacos almejam: aumentar a aceitação de fármaco, ao aumentar a quantidade de fármaco disponível no local alvo e minimizar efeitos secundários, ao reduzir a exposição de células e tecidos saudáveis aos agentes terapêuticos. Conseguir esta administração focada em células doentes pode ser conseguida de várias formas, desde exploração das características físico-químicas das células ou tecido alvo, ou usando estímulos externos para guiar o sistema ou induzir a libertação do fármaco. Em trabalho prévio, Cuphen, um composto de cobre e fenantrolina com efeitos de oxidação do ADN e inibição de aquaporinas, foi incorporado em lipossomas. Tanto o Cuphen livre como os liposomas com Cuphen exibiram baixa atividade hemolítica e nenhuma toxicidade in-vivo, mantendo ao mesmo tempo alta citotoxicidade contra linhas celulares de melanoma e cancro do cólon. Recentemente, outras formulações com Cuphen foram testadas num modelo singénico murino de melanoma, exibindo sensibilidade ao pH e debilitando seriamente o crescimento tumoral. Como as formulações prévias, estes lipossomas com Cuphen também exibiram baixa atividade hemolítica e nenhuma toxicidade in-vivo. As formulações desenvolvidas no trabalho mencionado baseavam-se em direcionamento passivo do sistema, explorando o efeito de Permeação e Retenção Aumentadas para facilitar a acumulação dos lipossomas, e usando o característico baixo pH do ambiente tumoral para libertar o fármaco. O apelo dos lipossomas como sistemas de entrega de fármacos advém da sua flexibilidade: vesículas lipídicas, constituídas por uma ou mais bicamadas lipídicas separadas por meios aquosos, torna estes sistemas compatíveis tanto para a incorporação de compostos hidrofílicos como hidrofóbicos. Além disso, a própria composição lipídica das vesículas pode ser feita à medida da utilização, sendo possível, por exemplo, alterar a rigidez, sensibilidade ao pH e tempo de circulação destes sistemas O processo de produção dos lipossomas pode também ser ajustado para obter lipossomas de um determinado diâmetro, aumentando ainda mais a flexibilidade deste sistema. Neste projeto, nanopartículas de óxido de ferro foram incorporadas em lipossomas sensíveis ao pH com Cuphen, para adicionar direcionamento físico à formulação. A produção dos lipossomas foi feita pelo método de desidratação e rehidratação, com uma composição lipídica baseada no trabalho prévio do grupo de investigação, que como mencionado obteve um sistema de entrega de Cuphen funcional no modelo animal, sem toxicidade. O direcionamento magnético serviria para aumentar a retenção dos lipossomas de longa circulação nos locais tumorais, e consequentemente melhorar a resposta ao tratamento ao disponibilizar mais Cuphen, mais rapidamente, às células-alvo. A utilização de magnetossomas em aplicações médicas tem visto alguma investigação: sistemas de imagem e terapia, chamados de teranósticos, podem explorar a versatilidade dos lipossomas e a sensibilidade das nanopartículas de óxido de ferro a campos magnéticos, sendo que as partículas tanto são um bom contraste de Ressonância Magnética como podem ser usadas para despoletar a libertação do fármaco. Para produzir as nanopartículas de óxido de ferro, foi necessário encontrar um método documentado que produzisse nanopartículas biocompatíveis e solúveis em água de forma simples e rápida, visionando uma facilitação de uma possível ampliação da produção. Um método fácil, de um passo, assistido por microondas foi usado para produzir nanopartículas de óxido de ferro revestidas com Dextrano, conseguido ao modificar um processo documentado com um revestimento que, segundo a literatura, permitiria produzir partículas com características semelhantes às do processo original, mas reduzindo a quantidade de passos necessários na produção. O revestimento das nanopartículas serve tanto para aumentar a biocompatibilidade das mesmas como para reduzir a agregação. As nanopartículas assim produzidas eliciaram uma resposta hemolítica inferior a 4% e não interferiram com a atividade citotóxica do Cuphen. A citotoxicidade das nanopartículas de óxido de ferro, Cuphen e combinação de nanopartículas com Cuphen foram avaliadas pelo teste colorimétrico MTT, onde um composto amarelo é metabolizado pelas células viáveis em cultura para um composto púrpura, quantificável por espectrofotometria. A validação do método de produção de magnetossomas foi conseguida através de um teste de centrifugação, onde lipossomas com Cuphen e magnetosomas com Cuphen foram expostos a um ciclo curto de centrifugação numa centrífuga de bancada. Segundo o trabalho previamente executado pelo grupo de investigação, os lipossomas com Cuphen com um diâmetro inferior a 200 nm não precipitam quando submetidos a um ciclo de centrifugação de 15,000 × g durante 30 minutos. necessitando no mínimo da aplicação de 250,000 × g durante 120 minutos. Os lipossomas com Cuphen não precipitaram, enquanto os magnetosomas com Cuphen formaram um precipitado, com 59 e 80% do lípido total para magnetossomas de 170 e 270 nm, respetivamente., Foi também verificada uma redução da eficiência de incorporação do Cuphen nos magnetossomas: 59 e 66% para magnetossomas de 170 e 270 nm, respetivamente, comparativamente ao valor obtido para lipossomas de Cuphen (100 e 88% para 170 e 270 nm, respetivamente) A quantificação do teor de lípido e Cuphen nas formulações desenvolvidas foi baseada em métodos colorimétricos. Os magnetossomas também foram testados em termos de atividade hemolítica, exibindo atividade abaixo dos 5%, sendo por isso considerados seguros para administração intravenosa. Para validar as propriedades magnéticas dos magnetossomas, foi desenhado um teste in vitro de magnetismo, onde um volume da suspensão dos magnetossomas foi colocado numa placa e exposto ao campo de um íman permanente de Neodímio-Ferro-Boro durante tempos diferentes. A concentração de lípido e Cuphen iniciais bem como nas zonas sobre o íman e opostas ao íman foram quantificadas. De facto, os magnetossomas exibiram qualidades magnéticas: a exposição a um campo permanente resultou num aumento de 31% da concentração de Cuphen por cima da zona do íman, ao fim de 19 horas. Contudo, não se observaram variações em termos de concentração de lípido sobre as mesmas áreas em estudo. Para além disso, quando o teste foi repetido com Cuphen na forma livre e partículas de óxido de ferro não incorporadas, não se obtiveram os mesmos resultados que com os magnetossomas. No futuro, métodos de quantificação de ferro podem ser utilizados para conseguir avaliar diretamente a eficiência de incorporação das nanopartículas, o método de produção das nanopartículas de óxido de ferro pode ser ajustado para produzir partículas mais pequenas de forma consistente, e testes in-vivo podem ser conduzidos num modelo animal para confirmar se o direcionamento extra providenciado pelas nanopartículas se traduz num aumento da resposta ao tratamento.Melanoma is an aggressive cancer that can easily be mistaken with normal skin features, like moles, when in early stages. This complicates early diagnosis, so effective therapeutic solutions for melanoma in more advanced stages is vital for patient quality of life and survivability. If surgery is not applicable, the standard option for advanced stage melanoma is chemotherapy with dacarbazine, but low positive response and overall survival rates encourage research into other treatment options. Any therapeutic option used will inevitably result in adverse side effects, which can be minimized by using a drug delivery system. Drug delivery systems aim to both increase drug uptake, by enhancing drug availability at target sites, and minimizing adverse side effects, by reducing healthy cell exposure to the therapeutic agents. This targeting of unhealthy cells can be achieved in different ways, from exploiting the physiochemical characteristics of the target cells or tissue, to utilizing external stimuli to guide the drug delivery system or induce drug release. In this work, iron oxide nanoparticles were prepared and incorporated into Cuphen pH-sensitive liposomes for a further targeting delivery using external stimuli. Cuphen is a copper-phenanthroline compound with both DNA oxidising and aquaporin inhibition effects and it has been shown promising results in melanoma cell lines using liposomal formulations. Now, a one-step microwave assisted method was used to produce Dextran coated iron oxide nanoparticles, which elicited a low haemolytic response and did not interfere with Cuphen’s cytotoxic activity. The resulting magnetosomes were guided to a target area via a magnetic field: exposure to a permanent magnetic field resulted in an increase of Cuphen concentration over the magnet area. However, there was not a significant increase in lipid concentration over the magnet area when compared to free Cuphen. Further studies must be performed. As future strategies, iron quantification methods can be employed to directly quantify the iron oxide nanoparticles’ incorporation efficiency and the iron oxide nanoparticle production method can be adapted to consistently make smaller particles, and, finally, in-vivo tests can be conducted in an animal model to confirm whether the added targeting capabilities translate into an increase in treatment response
