Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2018A forma esporádica da doença de Alzheimer (DA) é atualmente a causa mais comum de demência a nível mundial, estando particularmente associada ao envelhecimento da população. Esta caracteriza-se por um declínio cognitivo progressivo, acompanhado por atrofia cerebral generalizada. Uma vez que o hipocampo é uma das primeiras estruturas a ser afetadas, notáveis défices de memória podem ser observados nas fases iniciais da doença, nomeadamente na memória episódica de longo prazo, agravando-se progressivamente até uma completa dependência dos respetivos cuidadores. Estas alterações estão normalmente associadas a uma acumulação gradual excessiva de depósitos de péptido β amiloide (Aβ) no cérebro dos doentes, bem como à deposição de proteína tau hiperfosforilada.
Mais recentemente, a acumulação de oligómeros solúveis de Aβ em fases pré-clínicas da doença algumas décadas antes das primeiras manifestações sintomáticas, tem sido apontada como fator iniciador da cascata de eventos subjacente à patofisiologia da DA. Apesar da sua crescente incidência, as alternativas para o tratamento da DA são ainda bastante limitadas, e apenas permitem minimizar alguns dos sintomas a curto prazo. Desta forma, uma melhor compreensão dos mecanismos patofisiológicos será essencial para explorar terapêuticas inovadoras e mais eficientes.
A neurogénese pós-natal na zona subgranular (ZSG) do giro dentado (GD) do hipocampo ocorre através de um processo sequencial relativamente conservado entre mamíferos, no qual novos neurónios funcionais são originados a partir de células estaminais/progenitoras neurais (CSPNs) indiferenciadas e com capacidade de autorrenovação. Este processo parece contribuir significativamente para funções dependentes do hipocampo, como plasticidade sináptica e funções cognitivas, particularmente aprendizagem e memória, pelo que tem sido sugerido como um potencial alvo terapêutico da DA. No entanto, estudos in vivo e in vitro, referentes à forma como a neurogénese poderá ser modulada nesta patologia apresentam resultados altamente controversos, provenientes na sua maioria do uso de modelos da forma familiar da doença. Assim, a maioria dos estudos indica uma diminuição da proliferação e diferenciação, embora um aumento também seja mencionado por alguns autores e, mais raramente, ausência de alterações. Desta forma, o principal objetivo do presente projeto consistiu em caracterizar a neurogénese pós-natal no hipocampo, utilizando um modelo animal que pretende mimetizar as fases iniciais da forma esporádica da DA.
Para o estudo da proliferação e diferenciação celular, ratos Wistar jovens-adultos (9-10 semanas) foram injetados intraperitonealmente com 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) (100 mg/kg) durante 3 dias consecutivos, no início do protocolo. Seguidamente, com o objetivo de obter o modelo de doença proposto, realizaram-se cirurgias para a injeção intracerebroventricular (icv) unilateral de uma solução de péptido Aβ1-42 (2.25 mg/ml, 4 μl), ou de uma solução veículo (4 μl), no caso dos animais controlo. Duas semanas após esta injeção, foram efetuados testes comportamentais, durante a fase noturna e diurna do ciclo circadiano, incluindo o teste do campo aberto (do inglês, open-field), para avaliação da atividade locomotora, e o teste de reconhecimento do novo objeto (novel object recognition), para avaliação da memória episódica de longo prazo. Outros paradigmas foram avaliados apenas durante o dia, nomeadamente comportamento do tipo ansioso, pelo labirinto elevado em cruz (elevated plus maze), memória de curto prazo, pelo labirinto em Y (Y-maze) de alternância espontânea ou alternância forçada, e aprendizagem e memória espaciais, pelo labirinto de Morris (Morris water maze). No final do protocolo, os animais foram sacrificados para uma posterior análise celular e molecular, maioritariamente focada no GD. Adicionalmente, o efeito de uma solução de Aβ (20 μM) preparada a partir da solução utilizada in vivo foi também examinado em culturas primárias de neurónios corticais.
De acordo com o antecipado, a administração de Aβ1-42 não originou alterações significativas da atividade locomotora, no período noturno ou diurno, nem alterações no comportamento do tipo ansioso, paradigmas que poderiam influenciar o desempenho cognitivo dos animais. Contrariamente à literatura, não foram observados défices de memória a curto prazo, embora no caso do Y-Maze de alternância forçada, o desempenho dos ratos controlo parecesse estar comprometido. Relativamente à memória episódica de longo prazo, quando o teste foi realizado durante a noite, os resultados foram semelhantes aos observados no teste Y-Maze, isto é, não foram identificados défices nos ratos injetados com Aβ mas sim nos controlos, sugerindo um possível efeito deletério da solução veículo. Por outro lado, quando o teste foi realizado durante o dia, ambos os grupos apresentaram um comprometimento no desempenho da memória, possivelmente associado a uma menor atividade exploratória, no caso do grupo com Aβ. No que respeita à aprendizagem e memória espaciais, funções mais especificamente dependentes do hipocampo, não foram detetadas quaisquer alterações.
A nível molecular, não foi observada qualquer tendência para variações nos níveis de Aβ1-42 na sua forma solúvel no GD de ratos sacrificados 3 ou 14 dias após as cirurgias, analisado por ELISA. Não foi também detetada a presença de depósitos de amiloide no cérebro destes animais, após marcação histológica com vermelho do Congo.
Tem sido demonstrado que a sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, do inglês brain-derived neurotrophic factor) está comprometida nos neurónios na presença de Aβ, devido à clivagem dos seus recetores tirosina cinase B full-length (TrkB-FL), através de um processo dependente da ativação de calpaínas. Assim, os níveis destes recetores bem como do respetivo domínio intracelular (TrkB-ICD) originado pela clivagem, foram utilizados como medida indireta da presença de Aβ. Os resultados obtidos por western-blot indicaram a ausência deste mecanismo de neurotoxicidade induzida por Aβ. De facto, não parece haver qualquer tendência para alterações nos níveis de TrkB-FL ou TrkB-ICD no GD, mas também na zona sub-ventricular, analisada por ser uma região mais próxima do local de injeção, 3 ou 14 dias após a mesma. No entanto, o péptido em solução pareceu estar funcionalmente ativo, na medida em que resultados preliminares das experiências realizadas in vitro revelaram uma tendência para a clivagem dos recetores TrkB, ou seja, uma diminuição nos níveis de TrkB-FL, acompanhados por um aumento de TrkB-ICD e pela ativação de calpaínas.
Os marcadores de neurogénese foram analisados no final do protocolo, aproximadamente 30 dias após a primeira injeção de BrdU, com foco apenas na porção dorsal do hipocampo, uma vez que esta parece estar mais intimamente relacionada com funções cognitivas, como memória espacial e discriminação de padrões. Os resultados obtidos nas duas amostras analisadas (AβI e II), embora preliminares, são discrepantes. Ainda que na amostra AβI não tenha sido observada uma alteração no volume do GD dorsal, na amostra AβII observou-se uma tendência para a sua diminuição, consistente com o observado em modelos animais transgénicos e doentes com DA, mesmo em fases pré-clínicas ou iniciais. Relativamente à proliferação celular (BrdU+) e à diferenciação em neurónios maturos (BrdU+NeuN+), não parece haver uma tendência para alterações em qualquer uma das amostras. Em AβI, observou-se uma tendência para um aumento da proliferação de neuroblastos e diferenciação em neurónios imaturos (BrdU+DCX+), embora sem diferenças no número total de neuroblastos/neurónios imaturos (DCX+). Contrariamente, em AβII, ainda que não parecesse haver uma alteração na proliferação de neuroblastos e diferenciação em neurónios imaturos (BrdU+DCX+), o número total de neuroblastos/neurónios imaturos (DCX+) tendeu a diminuir. Estes resultados divergem maioritariamente daquilo que tem sido reportado em alguns modelos esporádicos da doença, os quais apontam para uma diminuição da proliferação e diferenciação, apesar de, até à data, a neurogénese não ter sido avaliada especificamente no modelo utilizado no presente trabalho.
Não obstante a injeção icv de péptido Aβ1-42 tenha sido previamente descrita como uma forma de obter um modelo da forma esporádica da DA, nas condições do nosso trabalho não foi possível observar o fenótipo esperado. No futuro, para que seja possível extrapolar acerca do potencial papel da neurogénese na cognição dependente do hipocampo, torna-se necessário aumentar o tamanho da amostra ao nível da análise molecular e celular, assim como proceder à otimização metodológica do protocolo utilizado.Sporadic late-onset Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia worldwide. It is characterized by a progressive cognitive decline, with a noteworthy episodic long-term memory impairment at early stages that eventually leads to dementia, and is accompanied by a gradual excessive accumulation of amyloid β (Aβ) peptide in the brain. Present treatment options for AD are very limited, so understanding its pathophysiology is essential for exploring efficient disease-modifying therapies.
Adult hippocampal neurogenesis occurs in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) through a relatively conserved process across mammalian species, that allows the generation of new functional granule cells (GCs) from undifferentiated neural stem/progenitor cells (NSPCs). This is thought to play a significant role in hippocampus-dependent synaptic plasticity and cognitive abilities, namely learning and memory. However, how neurogenesis is modulated in the different stages of AD remains unclear, as results from in vitro and in vivo animal studies are controversial, and arise mostly from models of the familial form. Therefore, the focal aim of this project was to characterize a rat model mimicking the initial stages of sporadic AD regarding adult hippocampal neurogenesis.
To study cell proliferation and differentiation, young-adult male Wistar rats were injected intraperitoneally with 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) (100 mg/kg) at the beginning of the protocol. Next, with the purpose of obtaining our model of disease, intracerebroventricular (icv) injections of an Aβ1-42 peptide solution (2.25 mg/ml, 4 μl) were performed. Behaviour tests were carried out two weeks after the icv injection, including the open field (OF), the novel object recognition (NOR), the elevated plus maze (EPM), the Y-maze spontaneous alternation (SA) and forced alternation (FA), and the Morris water maze (MWM) tests. Animals were sacrificed at the end of the protocol for cellular and molecular analysis, focusing mainly on the DG. Moreover, the effect of the Aβ peptide solution (20 μM) used in the in vivo experiments was parallelly examined in primary cortical neuronal cultures.
Our results showed that changes in locomotor activity and anxious behaviour were absent in Aβ1-42 injected rats. However, contrary to our expectations, results showed that Aβ1-42 administration did not impair spatial learning, short-term or long-term memory performance. Furthermore, there was no tendency for a change in the levels of soluble Aβ1-42 in the DG of rats sacrificed at 3 or 14 days post-surgery, and no amyloid deposition was depicted in the brain samples from these animals.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) signalling has been shown to be compromised in the presence of Aβ due to the cleavage of its tyrosine kinase B full-length (TrkB-FL) receptors, through a process dependent on calpain activation. Thus, the levels of these receptors as well as the intracellular domain fragment (TrkB-ICD) originated after cleavage were evaluated as an indirect measure of the presence of Aβ. Levels of TrkB-FL and TrkB-ICD did not tend to change 3 or 14 days after the injection, indicating absent Aβ-induced neurotoxicity. Importantly, preliminary results from in vitro experiments point to TrkB-FL receptor cleavage and calpain activation, suggesting the presence of a functionally active peptide in solution.
Neurogenesis was assessed at the end of the protocol, approximately 30 days after the first BrdU injection. Regarding the dorsal DG volume, one of the two samples showed a trend for reduced volume. Moreover, there does not appear to be any changes in cell proliferation (BrdU+) or in mature neuron differentiation (BrdU+NeuN+). Concerning the total number of neuroblasts and immature neurons (DCX+), as well as neuroblast proliferation and immature neuron differentiation (BrdU+DCX+), further analyses are needed, since results from the two samples demonstrated very distinct trends.
The icv Aβ1-42 peptide injection, as performed herein, has been previously described as a model of sporadic AD, yet the expected phenotype was not observed under the conditions of the present work. Increasing the sample size for the cellular and molecular analyses and further methodological optimization are sought in the future
