Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019A memória refere-se ao armazenamento de informação previamente aprendida. Esta capacidade permite que os animais ajustem e adaptem o seu comportamento ao ambiente, de acordo com aquilo que experienciaram. Assim, um dos mais fascinantes e centrais desafios da ciência moderna é a compreensão dos mecanismos neuronais que estão na base da aquisição e armazenamento de informação. Atualmente, pensa-se que a plasticidade sináptica esteja envolvida numa grande variedade de funções cerebrais, incluindo aprendizagem e memória. Em particular, a investigação desenvolvida tem-se concentrado em plasticidade sináptica dependente de atividade neuronal, como é o exemplo da potenciação de longa duração (LTP, do inglês long-term potentiation) ou da depressão de longa-duração (LTD, do inglês long-term depression) enquanto modelos celulares que estão na base da memória. Modelos clássicos de manutenção de LTP distinguem, pelo menos, duas fases: uma fase inicial (E-LTP, do inglês early long-term potentiation), independente de síntese proteica, que persiste durante minutos e uma fase tardia (L-LTP, do inglês late long-term potentiation), dependente de síntese proteica.
A indução de LTP é específica em relação ao input, ou seja, apenas as sinapses ativadas são potenciadas. Isto implica que macromoléculas necessárias para a manutenção de LTP, PRPs (do inglês plasticity-related proteins), devem ser, de alguma forma, recrutadas para sinapses ativadas. A hipótese de tagging e captura sináptica (STC, do inglês Synaptic Tagging and Capture), introduzida por Frey e Morris em 1997, propôs um mecanismo celular que concilia a especificidade de input da plasticidade sináptica com a alocação de PRPs. O modelo STC propõe que a atividade neuronal leva à formação de uma tag nas sinapses ativadas. A tag, temporalmente e espacialmente limitada, permite a essas sinapses a captura de moléculas necessárias à manutenção da plasticidade sináptica. Assim, a indução de LTP através de tetanização forte tem como consequência dois eventos dissociáveis: o estabelecimento local de uma tag sináptica e a síntese de PRPs. A indução de LTP através de tetanização fraca não leva à síntese de PRPs; no entanto, leva ao estabelecimento de uma “tag”. De uma forma geral, é a interação entre a tag e as PRPs que permite a manutenção da plasticidade sináptica. Neste contexto, podem surgir formas cooperativas de plasticidade sináptica, como observado em experiências anteriores: formas transientes de plasticidade, induzidas por uma estimulação fraca das sinapses, podem ser convertidas em formas persistentes através da utilização de PRPs sintetizadas devido à estimulação forte recebida por outro grupo de sinapses. A competição sináptica é outra possibilidade, em situações de menor disponibilidade de PRPs ou maior número de tags ativas, por exemplo.
Embora não sejam ainda totalmente compreendidas, as vias de transdução de sinal responsáveis pelo estabelecimento da tag começam a ser elucidadas. De acordo com aquilo que se sabe atualmente, a tag dificilmente será equivalente a uma molécula (ou a um pequeno conjunto de moléculas). Em vez disso, a tag deve ser vista enquanto uma alteração local e transiente do estado da sinapse que, muito provavelmente, envolve uma complexa rede de proteínas e interações. Resultados anteriores do nosso grupo de laboratório demonstraram que o citoesqueleto de actina desempenha um papel crucial na captura de PRPs tanto para LTP como para LTD, suportando a hipótese de que uma remodelação dos filamentos de actina (F-actin), dependente de atividade sináptica, torna a sinapse localmente e transientemente permissiva a modificações plásticas. A proteína quinase CaMKII (do inglês Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II) demonstrou ser necessária para mecanismos de captura sináptica. A indução de plasticidade sináptica leva à dissociação da subunidade β da CaMKII do citoesqueleto de actina, algo necessário para a remodelação da sinapse. Esta deslocação (de cerca de 1 minuto) gera um sinal local que pode estar na base da tag sináptica. Curiosamente, a CaMKII leva à ativação de Cdc42 (do inglês cell division control protein 42 homolog), uma proteína pertencente à família das Rho GTPases, que também desempenha um papel central na regulação do citoesqueleto de actina nas espinhas dendríticas. A cofilina é uma proteína de distribuição ubíqua, cuja atividade leva à despolimerização dos filamentos de actina. Sabe-se que a Cdc42 está acima de PAK (do inglês p21-activated kinase), que promove a inibição da cofilina de duas formas. Por um lado, PAK fosforila e ativa a quinase LIMK (LIM-kinase), que, por sua vez, fosforila cofilina; por outro, bloqueia a atividade da fosfatase SSH (do inglês Slingshot homologue), inibindo assim a desfosforilação da cofilina e, consequentemente, a sua atividade. A Cdc42 é também responsável pela interação com a via N-WASP que leva à ativação do complexo Arp2/3, conhecido pelo seu papel na polimerização do citoesqueleto de actina. Foi previamente demonstrado que, ao contrário de outras Rho GTPases, a ativação da Cdc42 é restrita às espinhas dendríticas estimuladas (ou seja, demonstra especificidade de input), persiste durante mais de 30 minutos e depende da sinalização de BDNF (do inglês brain-derived neurotrophic factor).
Aqui, colocamos a hipótese de que a Cdc42 desempenha um papel essencial na persistência da plasticidade sináptica, sendo necessária para o estabelecimento de uma tag sináptica. Para testar esta hipótese, administrámos ML141, um inibidor farmacológico reversível e altamente seletivo para a Cdc42, em fatias hipocampais de ratos juvenis em simultâneo com o registo eletrofisiológico de fEPSPs (do inglês field excitatory post-synaptic potentials) no stratum radiatum da área CA1.
Em condições de controlo, uma tetanização forte ao nível das colaterais de Schaffer leva à indução de uma forma persistente de LTP. Contudo, demonstrámos que, se o mesmo tipo de tetanização coincidir temporalmente com o período de aplicação do inibidor de Cdc42, a potenciação decai rapidamente para valores de baseline, como se observa em formas transientes de LTP. Estes resultados sugerem que a indução de formas persistentes de LTP depende da atividade de Cdc42.
Para além de se ter revelado enquanto necessária para a indução de LTP persistente, a Cdc42 revelou também ser necessária para a sua manutenção de acordo com uma janela temporal limitada. Ou seja, quando a aplicação do inibidor de Cdc42 é feita 40 a 70 minutos depois da indução de LTP, podemos observar um decaimento da potenciação sináptica. No entanto, a destabilização da manutenção de LTP persistente deixa de se verificar quando a aplicação do inibidor é feita 70 a 100 minutos depois da indução de plasticidade sináptica.
Finalmente, foram efetuadas experiências de cooperação sináptica. Primeiro, uma via é estimulada com tetanização fraca; passados 30 minutos, uma segunda via independente é estimulada com tetanização forte, que induz uma forma persistente de plasticidade. Em condições de controlo, a via que recebeu a estimulação fraca – que, por si só, levaria à expressão de uma forma transiente de LTP – é capaz de converter o seu LTP numa forma de LTP mais estável e persistente devido à estimulação forte na outra via. No entanto, quando a atividade de Cdc42 é inibida entre as duas estimulações, apenas a via que é estimulada com tetanização forte expressa uma forma persistente de LTP. Estes resultados sugerem que a inibição de Cdc42 interferiu com mecanismos de tagging e captura de macromoléculas necessárias à manutenção da plasticidade sináptica.
De uma forma geral, os nossos resultados apoiam a hipótese de que a Cdc42, ao regular o citoesqueleto de actina, interfere com a plasticidade sináptica, desempenhando um papel crucial na mesma. Estas e outras observações relativas aos mecanismos através dos quais o citoesqueleto é remodelado em consequência de atividade neuronal podem ter profundas implicações na compreensão dos mecanismos que estão subjacentes aos processos de memória e de aprendizagem. Para além disso, podem fornecer importantes alvos terapêuticos para doenças neuropsiquiátricas (como doença de Alzheimer e esquizofrenia, por exemplo) em que foram já identificadas disfunções relacionadas com a actina ou com a complexa rede dos seus reguladores e interações que estabelecem entre si.Maintained forms of Long-term potentiation (LTP) require de novo protein synthesis of plasticity-related proteins (PRPs). Since LTP is input-specific, it was proposed that activated synapses are tagged so that synthesized proteins are captured at modified synapses (synaptic tagging and capture hypothesis - STC). Although the nature of the synaptic tag remains unclear, it is generally accepted that it must be a local and transient molecular alteration caused by synaptic activation which can capture PRPs. Several molecules have been implicated in LTP maintenance by synaptic tagging and capture mechanisms, namely CaMKII, PKA and BDNF. Previous results from our laboratory group have shown a critical role of actin dynamics in the tagging and capture of PRPs in both LTP and LTD, supporting the hypothesis that an activity-dependent remodeling of F-actin through CaMKII activation, renders the synapse locally and transiently permissive to plasticity modifications. Interestingly, CaMKII leads to activation of Cdc42, a Rho GTPase that also plays a role in regulating the actin cytoskeleton in dendritic spines. Cdc42 is known to be upstream of PAK (p21-activated kinase), that phosphorylates and activates LIM-kinase (LIMK), which, in turn, phosphorylates cofilin, inhibiting its actin-depolymerizing activity. Cdc42 is also responsible for interacting with the WAVE1/N-WASP pathway to activate Arp2/3 complex-dependent actin polymerization. One hypothesis is that Cdc42 activity promotes actin polymerization. Since Cdc42 activity has been shown to be heavily restricted to the stimulated spine (input-specificity), last more than 30 minutes and is dependent on BDNF signaling, we hypothesize that Cdc42 plays a crucial role in the setting of the synaptic tag. Here, we assess the role of Cdc42 in synaptic tagging and LTP maintenance by pharmacologically inhibiting Cdc42 activity while performing electrophysiological recordings in rat hippocampal slices. We found that inhibition of Cdc42 does not interfere with the expression of a transient form of LTP but blocks the induction of a maintained form of LTP. Moreover, the inhibition of Cdc42 blocks the maintenance of synaptic plasticity within a limited time window. Finally, we show that Cdc42 inhibition interferes with synaptic tagging and capture mechanisms. Since Cdc42 activation promotes actin polymerization we propose that Cdc42 inhibition may interfere with the maintenance of LTP by promoting actin depolymerization. Our results suggest that, by interfering with the actin cytoskeleton, Cdc42 interferes with synaptic plasticity
