Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018A frutofília é uma característica pouco comum entre os microrganismos, que consiste na preferência de frutose como fonte de carbono e energia. Em leveduras, até agora, esta característica foi reportada no género Zygossacharomyces e no clado Wickerhamiella/Starmerella (W/S). O comportamento frutofílico está relacionado com a presença do transportador de frutose, Ffz1, porém, o papel da frutose no metabolismo destas leveduras ainda não está completamente elucidado. Uma das leveduras que se destaca no clado W/S é St. bombicola não só pela facilidade em manipular esta espécie geneticamente, mas também por ser produtora de elevadas quantidades de soforolípidos. Estes são biosurfactantes que têm características favoráveis do ponto de vista ambiental e, são aplicados em áreas como a cosmética e produtos de limpeza. Além disso, St. bombicola assim como outras espécies pertencentes ao clado W/S foram reportadas como produtoras de elevadas quantidades de manitol a partir de frutose através da enzima manitol desidrogenase (Mtdh) utilizando NADPH como cofator, regenerando assim NADP+. Tendo em conta que a produção de manitol é uma via metabólica dependente de frutose, o objetivo desta tese foi tentar perceber qual o papel do manitol na levedura St. bombicola. Como St. bombicola possui dois genes que codificam para duas desidrogenases do manitol foram utilizados três mutantes de deleção previamente construídos: um mutante onde o gene que codificava para a enzima Mtdh1 (mtdh1Δ) foi interrompido, outro para a enzima Mtdh2 (mtdh2Δ) e, finalmente um mutante duplo (mtdh1Δmtdh2Δ). A estirpe selvagem e mutantes de deleção foram cultivados, num meio onde o comportamento frutofílico é visível designado por 20FG (contendo 10 % (w/v) de frutose e 10 % (w/v) de glucose) onde a produção de manitol foi estudada. Não foi detetada produção de manitol pelos mutantes mtdh1Δ e mtdh1Δmtdh2Δ, porém foi detetada produção de manitol semelhante à estirpe selvagem pelo mutante mtdh2Δ, o que permitiu inferir que a principal enzima responsável pela conversão de frutose em manitol é a Mtdh1. Curiosamente, quando crescidos nesse mesmo meio a várias temperaturas (25 ºC, 30 ºC e 32.5 ºC), os mutantes de deleção (mtdh1Δ e mtdh1Δmtdh2Δ) não atingiam as mesmas densidades celulares que a estirpe selvagem às temperaturas mais elevadas. Além disso, excluímos também a possibilidade de os mutantes de deleção terem algum tipo de dificuldade em consumir especificamente um dos açúcares usados, glucose e frutose, cultivando-os em 20 % (w/v) glucose e em 20 % (w/v) de frutose uma vez que nestes meios os mutantes continuavam sem atingir as mesmas densidades celulares que a estirpe selvagem. Tendo em conta a elevada osmolaridade do meio utilizado assim como as diversas descrições do papel do manitol como osmoprotetor, foi avaliado o crescimento dos mutantes de deleção num meio onde a pressão osmótica é baixa, 2FG contendo 1 % (w/v) de frutose e 1 % (w/v) de glucose, a 30 ºC e 32.5 ºC. Curiosamente, a 32.5 ºC os mutantes de deleção não conseguiam sequer crescer. O facto de o defeito no crescimento ser ainda mais pronunciado neste meio de cultura permitiu-nos excluir a possibilidade de o manitol funcionar como osmoprotetor em St. bombicola. Além disso, a taxa de crescimento da estirpe selvagem e dos mutantes de deleção foi também analisada a 25 ºC, 30 ºC e 32.5 ºC. Porém, não foi detetada qualquer diferença na taxa de crescimento entre a estirpe selvagem e os mutantes de deleção a 25 ºC e a 30 ºC o que sugere que as diferenças que observamos são de facto no rendimento em biomassa e não na velocidade de crescimento. A adição de sorbitol (18% (w/v) ao meio 2FG a 32.5 ºC repõe a capacidade de crescimento dos mutantes. Contudo, o sorbitol pode ser metabolizado quando presente em elevadas concentrações. No entanto, quando cultivámos um mutante duplo – onde o gene que codifica para uma enzima necessária para a metabolização do sorbitol (SOR1) foi interrompido assim como o gene MtDH1, mtdh1Δsor1Δ - verificamos que esse mutante ainda consegue crescer o que indica que o sorbitol poderá substituir o papel do manitol na célula e que o poliol em si tem de facto um papel no crescimento a elevadas temperaturas. Esta conclusão é corroborada quando a estirpe selvagem e os mutantes de deleção foram cultivados no meio contendo 1 % (w/v) de glucose e 1 % (w/v) de frutose ao qual foi adicionado 18% (w/v) manitol e os mutantes de deleção atingiam densidades celulares semelhantes à estirpe selvagem a 32.5 ºC. Tendo em conta que os mutantes de deleção não atingem as mesmas densidades celulares que a estirpe selvagem e, que é algo que parece estar intimamente relacionado com a temperatura a produção intracelular e extracelular de manitol foi analisada no meio 20FG a 20 ºC, 25 ºC e 30 ºC. Curiosamente, um aumento do rendimento intracelular de manitol é observado assim como extracelular o que sugere que o manitol desempenha um efeito protetor na célula contra o stress térmico, possivelmente tendo um papel estabilizador da membrana como a trealose em S. cerevisiae, em que os grupos hidroxilo formam pontes de hidrogénio com a bicamada lipídica da membrana. Esta explicação coaduna-se com o facto de, em S. cerevisiae a trealose ser necessária dos dois lados da membrana para garantir proteção uma vez que, em St. bombicola, não só a produção de manitol intracelular, mas também a quantidade extracelular de manitol aumenta com a temperatura. Em suma, durante esta dissertação foi possível fazer uma contribuição significativa relativamente ao papel da produção de manitol em St. bombicola. Esse papel poderá residir no efeito termoprotector do próprio manitol, mas também na manutenção do equilíbrio redox das vias do metabolismo central.Fructophily is a rare trait that consists in the preference of fructose over glucose as carbon and energy source. In spite of the fact that it is already known that fructophily in yeasts is intimately related with the presence of a high capacity fructose transporter called Ffz1, the importance of fructose in the metabolism of fructophilic yeasts is not well established yet. St. bombicola converts fructose directly into mannitol through a mannitol dehydrogenase (Mtdh) which uses NADPH as a cofactor. In order to understand the role of mannitol in this yeast, three deletion mutants previously constructed, where the genes encoding for Mtdh were disrupted (mtdh1Δ, mtdh2Δ, mtdh1Δmtdh2Δ) were used. Growth assays were performed at three temperatures 25 ºC, 30 ºC and 32.5 ºC and it was possible to observe that the MtDH deletion mutants did not reach the same cell densities as the wild-type. Also, at the highest temperature tested (32.5 ºC) and at low sugar concentrations, the MtDH deletion mutants were not even able to grow. The ability to grow was restored through the addition of exogenous polyols like mannitol and sorbitol, suggesting that these polyols could be replacing the function of mannitol produced by the cell. Also, the intracellular mannitol content produced by the wild-type increased at higher temperatures, suggesting a role as thermoprotector. It seems possible that mannitol, like trehalose in S. cerevisiae, can stabilize the lipid bilayer of the plasma membrane through hydrogen bonding. In this thesis we were able to make a significant contribution to elucidate the role of mannitol production in St. bombicola. The first role may be as thermoprotector in the cell and the second role may be related with redox homeostasis
