Bešić, Nikola

Bilban-Jakopin, Cvetka

Hočevar, Marko

Krajc, Mateja

Lokar, Katarina

Novaković, Srdjan

Stegel, Vida

Žgajnar, Janez

Slovene

Digital repository of Slovenian research organizations

DOKAZOVANJE MUTACIJ V BRCA1 GENU ZANALIZO TALITVENE KRIVULJE PCR PRODUKTOVSrdjan Novaković, Vida Stegel, Mateja Krajc, Janez.Žga1nar,Nikola Bešić, Marko Hočevar, Cvetka Bilban Jakopin'Katarina Lokaronkološki inštitut LjubljanaPovzetekRak dojke je z nekaj več kot 1000 novimi bolnicami na leto na. prvem mestu poštevilu obolelih Žensk za rakastimi boleznimi v Sloveniji. Številka vključujesporadične in dedne oblike raka dojk. Dedne oblike raka dojke so najpogo-słeje povezane z mutacijami v BRCA1 in BRCA2 genih' Zato se številni stro-kovnjaki s tega podro ćia zavzemď1o za genetsko testiranje bolnikov, pri kate-rih o'bstaja .ut na dedno obliko bolezni. Testiranje bolnic/kov in njihovihsorodnikov je dokaj teŽavno zaradi zahlevnosti metod genetskega testiranja'stroškov testiranja in nezadostnega poznavanja in predvidevan|a vseh moŽnihvplivov dokazane mutaciie pri nastanku raka dojke. V tem delu predstavljamoo.noun" metodološke podatke za odkrivanje petih različnih mutacij v BRCA1genu pri bolnicah/kih s karcinomom dojke in njihovih sorodnikih. Mutacijeia06i'T, 3ooT>G, 3ooT>A, 31oG>A, 5382ins6 določamo s pomočjo polime_razne veriŽne reakcije (PCR) v realnem času in analizo talitvene krivulje. Pri-merjava z direktnim sekveniranjem le pokazala, da je uporabljena metoda do-volj bbčutljiva in hitra za dnevno rutinsko določanje mutacij v DNA izolirani izperiferne krvi.UvodPet do 10% vseh primerov raka dojk so dedna oblika te bolezni. od vseh ded-nih rakov dojk so le{i posledica mutacij V genu BRCA1 v pribliŽno 20o/o do40% in v genu BRCA2 v 10% do 35%. lnciden ca raka doik je pri nosilkah/cihmutacij v genu BRCA1 okrog 50%. Poleg tega imajo nosilci teh mutacijpovečano tveganje za nastanek raka jajčnikov, širokega črevesa in prostate.v primeru, da poznamo vrsto in mesto mutacije, jih lahko relativno enostavnoin hitro dokaŽemo. Ena skupina metod za hitro določanje mutacij temelji napomnoŽevanju tistih delov gena, kjer mutacijo pričakujemo, ter vezavi speci-iičnin sono nä pomnoŽeno Ďľlł. lz nastalih razlikv talitveni krivulji prinemuti-ranih in mutiranih genih potrdimo prisotnost mutacij. V tem prispevku prikazu-59Mateľiali in metodeGenomsko DNA smo izolirali iz periferne krvi preiskovancev s pomočjo "DNAblood isolatiop fti1" (Quiagen, Hilden, Germany). primerje in sonde .ro r".-novali in oblĺkova|i v našem laboratoriju, sintetizirala pa jirl 1o firma TlB Molbiol(Berlin, Germany).PCR v realnem času in analizo ta|itvene krivulje smo opravili na Light Cyc|er-ju (Roche Molecular Biochemĺcals, Mannheim, Germany) po navoäilih proiz-vajalca (Light Cycler Fast Star1 master hybridization probes, Roche MolócularBiochemicals). Če na kratko povzamem - DNA smo pomnoŽili s pomočjo PCRz našimi primerji. K meŠanici smo dodali še specifične hibridizacijske sonde,ki so nosile fluorescentna barvila. Po končani PCR smo opravili talítveno anal-izo produktov, na katerih so biĺe Vezane sonde, ter uootovĺlĺ prisotnostmutacij.i^ń^ ^^ĺ^x^^l^ -^^^:LjctIlo oolocanje Znanln mutaciJ V geÍlu BRCAi - i806C>T, 300T>G' 3U0ĺ>A,31OG>A, 5382insC z uporabo PCR v realnem času.Rezultati ĺn dĺskusijaRazlične vrste raka so povezane z mutacijami v genih BRCA| in BRCA2. Mednajpogostejš|mi so rak dojk, jajčnikov, trebušne slinavke, prostate, jajcevodov,rak grla, ter levkemije in limfomi pri odraslih. Kljub Številnim vrstań rakov, kinastanejo kot posledica mutacij v omenjenih genih, so nosilke/ci teh mutacijpredvsem rizič,ne/i za nastanek raka dojk inlali jajčnikov. Mutacije v genihBRCA| in BRCA2 povečajo verjetnost nastanka raka dojk glede ná normalnopopulacijo tudi za 10x. Tveganje za nastanek raka jajčniŕov je pri nosilkahmutacij V genu BRCA1 glede na normalno populacijo 5-7x večje, medtem koje pri nosilkah mutacij V genu BRCA2 nekoliko manjše in je 2-ix večje kot prinormalnĺ populaciji.Upoštevajoč, da je s|ovenska populacija dokaj etnično omejena in da je rakdojk na prvem mestu od vseh rakastih bolezni pri Ženskah v Sloveniji, .'b l"taTabela 1. Mutacije pri stovenskih botnikih, ki smo jih določati z metodo PCR v realnemčasu ter z analizo talitvene krivutje produktov.- število pozitivnih Vzorcev,talitvene krivulje produktovsekvenčno anaIizoki smo jih določili z metodo PCR v realnem času in analizona Light Cycler_ju (LC)/število Vzorcev, ki smo jih potrdili sVrsta mutacije ŠtevilopreiskovancevŠtevjlo določenihmutacijŠt. Lc pozitivnih/št' ssekv. reak. potrjenih -1 B06C>T 177 12 12/12300 T>c ot 4 4/4300T>A 5 0 0/231 oc>A 2 I 1/153B2insC 17 4 4/4602OO1 začeli z genetskim svetovanjem in testiranjem oseb, ki so navajale večprimerov raka dojk ali jajčnikov v druŽini.Na onkološkem inštitutu Ljubljana določamo prvenstveno tiste mutacije, ki soseizkazale kot najbolj pogoste v slovenskih druŽinah. Med te sodijo mutacijev genu BRCA| - 1806C>T, 300T>G, 300T>A, 310G>A, 5382insC in pridoblje-na slovenska mutacija lVS162A>G v genu BRCA2. Metoda, ki smo jo uvedli zatestiranje mutacij 1806C>T, 300T>G, 31OG>A in 5382insC v genu BRCA1,popolnoma korelira z rezultati sekvenčne analize, ki je bila opravljena vLaboratory of Medical Genetics - Vrije University Brussels fabela 1). Vprimeru mutacije 300T>A pa s to metodo nismo uspeli potrditi prisotnostimutacij, ki so jih sicer dokazali s sekvenčno analizo.ZaključekNa osnovi naših rezultatov in rezultatov sodelovanja z laboratorijem iz Brusljalahko zaključimo, da smo uspešno zasnovali in oblikovali primerje in sonde zadokazovanje mutacij 1806C>T, 300T>G, 31OG>A in 5382insC v genu BRCA1 .Po optimizaciji je metoda PCR v realnem času in analiza talitvene krivulje pro-duktov izredno občutljiva (senzitivna) in kot taka uporabna za do|očanje mutacij.Čeprav smo primerje za mutacijo 300T>A pravilno izbrali in pripravili, metoda nibila dovolj občutljiva in je toĘ neuporabna za rutinsko določanje te mutacije.Vĺľĺ in lĺteľatuľa1. Roest PAM, Roberts RG, Sugino S, van Omen GJB, den Dunnen JT. Protein trunca-tion test (PTT) for rapid detection of translationłerminating mutation' Hum Mol Genet1993;2: 1719-21.2. Hayashi K, Wenz HM, lnazuka M, Tahira T, Sasaki T, Atha DH. SSCP analysis of poĺntmutations by multicolor capillary electrophoresis. lveihods Mol Biol 2001; 163: 109-26.3. Myer RM, Lumelsky N, Lerman LS, Maniatis T. Detection of single base substitutionin total genomic DNA. Nature 1985; 313: 495-8.4. Foy CA, Parkers HC. Emerging homogeneous DNA-based technologies in the clinicallaboratory. Clin Chem 2001 ; 47 : 990-1 000.5. Wilhelm J, Pingout A. Realłime polymerase chain reaction. Chembiochem 2003;4:1120-8.6. Gerard Ę Pindoiia MS, Worsham MJ. A rapid and sensitive approach to mutationdetection using real-time polymerase chain reaction and melting curve analyses,using BRCA1 as example. Mol Diagn 1999; 4:241-6.7. DeVita TV, Hellman S, Rosenberg AS, editors. Principles and practice oÍ oncology 7thedition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005.B. King MC, Marks JH, Mandell JB. Breast and ovarian cancer risks due to inheritedmutations in BRCAI and BRCA2. Science 2003; 302: 643-6.619. Loman N, Johannsson O, Kristoffersson U, Olsson H, Borg A. Family history ofbreast and ovarian cancers and BRCAI and BRCA2 mutations in a population-based series of early-onset breast cancer. J Natl Cancer lnst 2001 ; 93: 1 21 S-23.10' Struewing JĘ Hartge Ę Wacholder S, Baker SM, Berlin M, McAdams M,Timmerman MM, Brody LC, Tucker MA.The risk of cancer associated with speciÍicmutations oŤ BRCA1 and BRCA2 among Ashkenazi Jews. N Engl J Med 'l997; 336:1 401 -8.62

Dokazovanje mutacij v BRCA1 genu z analizo talitvene krivulje PCR produktov

http://dirros.openscience.si/Dokument.php?id=11825&dn=

Dokazovanje mutacij v BRCA1 genu z analizo talitvene krivulje PCR produktov

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Digital repository of Slovenian research organizations