Kraigher, Hojka

Mrak, Tanja

Digital repository of Slovenian research organizations

23Laserska mikrodisekcija je orodje za izolacijo spe-cifičnih tkiv, celic, subcelularnih struktur in orga-nelov iz mikroskopskih preparatov kompleksnih heterogenih tkiv. Vzorci, pridobljeni na ta način, so primerni za ekstrakcijo DNK, RNK, proteinov in metabolitov (Emmert-Buck s sod. 1996; Day s sod. 2005; Moco s sod. 2009). Mikroskopske pre-parate, ki so lahko v nekaterih primerih pripravljeni na običajnih objektnih steklih ali pa na posebnih objektnih steklih z membranami, opazujemo pod invertnim ali pokončnim mikroskopom, laserski ža-rek pa potuje skozi leče objektiva. Preparati mora-jo biti pripravljeni brez krovnih stekel, če pa upora-bljamo arhivske vzorce, je potrebno krovno steklo pred lasersko mikrodisekcijo odstraniti. Prve aparature za lasersko mikrodisekcijo so de-lovale tako, da je IR laserski žarek aktiviral termo-plastični film nad mikroskopskim preparatom, pri čemer so se izbrane celice pod filmom prilepile nanj (Emmert-Buck s sod. 1996) in ta način upo-rabljajo še danes. Poleg tega so na voljo aparati, pri katerih se izbrani del tkiva izreže s pomočjo UV laserskega žarka, nato pa izrezani del bodisi pade v zbirno posodico pod njim zaradi težnosti bodisi se s pomočjo defokusiranega laserskega žarka katapultira v zbirno posodico nad njim. Ta dva načina sta natančnejša od prej omenjenega, saj omogočata izrezovanje delov, manjših od 1 μm (Day s sod. 2007). Ključna za uspešno lasersko mikrodisekcijo ter na-daljnje postopke ekstrakcije je priprava vzorca, pri čemer je potrebno ohraniti histološke podrobnosti, ki omogočajo izbor želenega dela tkiva, hkrati pa se morajo v vzorcu ohraniti tudi molekule, ki jih želimo v nadaljevanju analizirati. Za živalska tki-va se najpogosteje uporablja rezanje zamrznjenih tkiv s kriotomom, za rastlinska tkiva pa ta način ni najbolj primeren zaradi tvorbe ledenih kristalov v vakuolah in medceličnih prostorih, ki poškodujejo vzorec (Kerk s sod. 2003; Day s sod. 2005). Za fiksacijo tkiv se zaradi slabega izkoristka pri ek-strakciji nukleinskih kislin in proteinov izogibamo uporabi fiksativov, ki vsebujejo formalin. Namesto tega za rastlinska tkiva uporabljamo Farmerjev fik-sativ (mešanica etanola in ocetne kisline). Fiksacija poteka pri 4 °C, nadaljnji postopki dehidracije in vklapljanja v parafin pa kot pri pripravi klasičnih mikroskopskih preparatov. Odstranjevanje para-fina izvedemo tik pred lasersko mikrodisekcijo (Kerk s sod. 2003). Namesto parafina, kjer težavo predstavlja tako kontaminacija z RNazami kot vi-soka temperatura, ki ji je izpostavljeno tkivo, lahko uporabljamo vklapljanje v vosek, ki ima nizko tem-peraturo tališča (Gomez s sod. 2009), ali v meta-krilatno plastiko, ki polimerizira pri nizkih tempe-raturah (Klink in Thibaudeau 2014). Če želimo v nadaljevanju delati z RNK, moramo uporabljati re-agente, pipetne nastavke in plastično posodje, ki ne vsebuje RNaz v kombinaciji s tretiranjem vodnih raztopin z 0.1 % dietilpirokarbonatom ter pogosto menjavati rokavice (Carl Zeiss Microscopy 2012).  Za ekstrakcijo DNK in RNK uporabljamo komplete, namenjene majhnim vzorcem, na primer PicoPure DNA/RNA Extraction Kit (Life Technologies), QI-Amp DNA Micro Kit (Qiagen) ali RNeasy Micro Kit (Qiagen). LASERSKA MIKRODISEKCIJA – MOST MED MIKROSKOPIJO IN MOLEKULARNIMI TER FIZIKALNO-KEMIJSKIMI METODAMILaser microdissection – the bridge linking microscopy with molecular methods and methods of physical chemistryTanja Mrak*, Hojka KraigherGozdarski inštitut Slovenije, Oddelek za gozdno ﬁziologijo in genetiko, Večna pot 2, 1000 Ljubljana Ključne besede: laserska mikrodisekcija, mikroskopija, analiza tkivKeywords: laser microdissection, microscopy, tissue analyses«*e-naslov: tanja.mrak@gozdis.si                           24Pomnoževanje ekstrahirane DNK iz večjih vzorcev, pridobljenih z lasersko mikrodisekcijo, je relativno enostavno z uporabo verižne reakcije s polimerazo (PCR). Tako pomnožene markerje lahko nadalje anali-ziramo z več pristopi (sekvenciranje, fragmentna ana-liza, analiza polimorﬁzma posameznih nukleotidov, genotipizacija kratkih tandemskih ponovitev in drugo) (Day s sod. 2005). Kvantiﬁkacijo ekstrahirane RNK lahko opravimo spek-trofotometrično ali z občutljivejšimi ﬂuoroscentnimi sistemi detekcije. Za ocenjevanje kakovosti prido-bljene RNK lahko uporabljamo mikrokapilarno elek-troforezo ali PCR s predhodno obratno transkripcijo (RT-PCR), pri kateri pomnožujemo fragmente tako s 3' kot s 5' konca ter ugotavljamo njuno razmerje. Ker je količina RNK, izolirane z lasersko mikrodisekcijo, majhna, jo je običajno pred nadaljnjimi analizami tran-skriptov potrebno pomnožiti, npr. s PCR, in vitro-tran-skripcijo (IVT) ali z Ribo-Spia pomnoževanjem. Na-daljnje analize transkriptov zajemajo metode, kot so PCR, Northern blot, in-situ hibridizacija, konstrukcija reporterskih genov, mikromreže ter serijska analiza iz-ražanja genov (SAGE) (Day s sod. 2007).Analize proteinov (v zadnjem času pa tudi metaboli-tov) so omejene s količino posameznih tipov celic, ki jih lahko pridobimo z lasersko mikrodisekcijo in koli-čino produktov v njih. Za analizo proteinov v vzorcih, pridobljenih z lasersko mikrodisekcijo, uporabljamo gelsko elektroforezo, metodo imunoblot in masno spektrometrijo (MS) (Day s sod. 2005), za analize me-tabolitov pa metode, ki temeljijo na MS in jedrski ma-gnetni resonanci (NMR). Pred analizo z MS molekule ločimo z eno od separacijskih tehnik, kot so tekočin-ska in plinska kromatograﬁja ter kapilarna elektrofore-za (Moco s sod. 2009)Možnosti uporabe laserske mikrodisekcije v goz-darstvu in lesarstvu so številne in zajemajo raziska-Viri:                                                                         ?? ????????????????????????????????????????????????????????? (http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/laser-mic-rodissection/laser-microdissection-microbeam.html#downloads, april 2014).??? ???????????????????????????????????????????????????????????-cific! Laser-assisted microdissection of plant cells. TRENDS in Plant Science 10, 8: 397-406.??? ???????????????????????????????????????????????????????????????of laser microdissected plant cells. Physiologia Plantarum 129, 2: 267-282.??? ????????????????????????????????????????????????????????????-ang Z., Goldstein S.R., Weiss R.A., Liotta L.A. 1996. Laser Cap-ture Microdissection. Science, 274, 5289: 998-1001.??? ?????? ?????? ?????? ???? ???????????????? ???? ????????????? ????Tang Y., Blancaflor E.B., Udvardi M.K., Harrison M.J. 2009. Me-dicago truncatula and Glomus intraradices gene expression in cortical cells habroring arbuscules in the arbuscular mycorrhi-zal symbiosis. BMC Plant Biology,  9: 10.??? ??????????????????????????????????????????????????????????????????Laser Capture Microdissection of Cells from Plant Tissues. Plant Physiology, 132, 1: 27-35.??? ?????????????????????????????????????? ????????????????????????????sections from plastic-embedded tisssue for studying plant-orga-nism developmental processes at single cell resolution. Journal of Plant Interactions, 9, 1: 610-617.??? ??????????????????????????????????????????????????????????????-cs: The Analysis of Endogenous Metabolites Present in a Plant Cell or Tissues. Journal of Proteome Research, 8, 4: 1694-1703.ve interakcij med rastlinami in patogeni oz. simbionti v različnih fazah infekcije oz. kolonizacije, raziskave specializacije in diferenciacije celic, raziskave epige-netske regulacije ključnih genov, identiﬁkacijo end-oﬁtov, identiﬁkacijo komponent kompleksnih in hete-rogenih vzorcev, dendrokronologijo visoke ločljivosti v povezavi z izotopskimi analizami, izdelavo kromo-somskih knjižnic ipd. Zahvala: Pripravo prispevka je ﬁnanciral evropski projekt EU-FORINNO European Forest Research and Innovation (RegPot No. 315982), ﬁnanciran iz 7 okvirnega infra-strukturnega programa ter soﬁnancirala programska skupina »Gozdna biologija, ekologija in tehnologija« (P4-0107). Slika 1: Sistem za lasersko mikrodisekcijo PALM MicroBeam z invertnim mikroskopom ZEISS ter izvorom laserske svetlobe PALM (avtorica: Tanja Mrak)

Laser microdissection : the bridge linking microscopy with molecular methods and methods of physical chemistry

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Digital repository of Slovenian research organizations