Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Diferentes estudos desenvolvidos pelo nosso grupo envolveram colonização com Helicobacter hepaticus (Hh) reproduzindo um tipo de interação hospedeiro-microorganismo. Dados anteriores aos que são apresentados neste projeto reportaram que após a colonização com Hh em ratos adultos saudáveis B6 WT é desencadeada uma resposta robusta de imunoglobulina (Ig) específica contra Hh, acompanhada por uma redução da densidade bacteriana (dados não pulicados). Também foi observado que é necessária uma resposta de células B dependente de células T para controlar a densidade de Hh e que a citoquina responsável pela persistência de Hh, IL-10, é essencial para modular esta resposta. Curiosamente, aquando da colonização com esta bactéria em ratos neonatos B6 WT, a resposta de Igs específicas não se verificou e estes animais apresentaram densidades elevadas de Hh. Por fim, a tolerância a Hh – mediada por IL-10 e sustentada por células T regulatórias CD25+ – foi mantida mesmo quando os animais atingiram a idade adulta (dados não publicados). Tendo em conta as evidências referidas acima, o grande foco deste trabalho residiu no contraste entre a colonização com Hh no período neonatal e no adulto. Neste contexto, decidimos explorar o papel da presença de uma microbiota complexa na resposta de tolerância a Hh. Assim, a partir de animais GF (desprovidos de qualquer microorganismo) B6 foram produzidos animais Ad.mcol – colonização ig com Hh de cultura em ratos com 8 semanas e analisados 9 semanas pós-colonização – e animais Nb.mcol – nascidos a partir de mães mono-colonizadas com Hh e analisados com 9 semanas de idade. Semelhante ao que tinha sido demonstrado para animais SPF Nb.col (dados não publicados), não foi detetada IgA anti-Hh nas fezes de ratos Nb.mcol provando que a tolerância a Hh é independente da microbiota. Para além disso, demonstrámos que a Ig específica contra Hh se liga diretamente à sua superfície. Isto foi inferido através da incubação de extratos fecais de ratos Ad.col e Nb.col, usando como controlo negativo animais SPF, com Hh crescida em cultura. Posteriormente, a análise por citometria de fluxo confirmou que o anticorpo produzido especificamente contra Hh se liga efetivamente à sua superfície, o que ainda não tinha sido demonstrado até ao momento. A concentração de IgA detetada através de ELISA envolve a incubação de amostras de fezes com um lisado de Hh, sendo apenas determinada a IgA específica que a reconhece e se liga aos seus antigénios. Pelo contrário, uma vez que incubámos amostras de fezes com uma suspensão de Hh crescida em cultura no ensaio descrito acima, a integridade estrutural da parede celular bacteriana não foi comprometida. Assim, foi possível replicar a interação entre o sistema imunitário do hospedeiro e as bactérias num contexto in vivo, sendo considerado como um modelo plausível do que acontece ao nível fisiológico quando a IgA encontra estas bactérias intactas dentro do hospedeiro: a IgA reconhece os antigénios que se encontram na superfície de Hh presente no lúmen do intestino e a sua afinidade promove uma ligação específica; estes microorganismos ficam revestidos com IgA e impedidos de atravessar a barreira intestinal, mecanismo que ainda não é claro. Neste trabalho, também foram identificados os nichos intestinais ocupados por esta bactéria determinando a densidade de Hh em animais Rag2-/- (imunodeficentes), Ad.col e Nb.col. Os nossos dados após a análise da densidade de Hh por qPCR mostraram que a Hh está presente em maior densidade no caecum (em geral, 104 cópias de 16S de Hh por 16S total), de seguida no íleo e cólon (Rag2-/- = ~102 cópias de 16S de Hh/16S total; B6 Ad.col = ~1 cópia de 16S de Hh/16S total; B6 Nb.col = ~101-102 cópias de 16S de Hh/16S total) e em menor número no jejuno (Rag2-/- Ad.col e B6 Nb.col = ~10 cópias de 16S de Hh/16S total; B6 Ad.col < 1 cópia de 16S de Hh/16S total). Os animais Rag2-/- Ad.col exibiram ainda uma elevada densidade de Hh no recto comparativamente aos outros grupos (104 cópias de 16S de Hh/16S total). O facto de Hh ter sido isolada originalmente a partir do cólon e também do fígado de ratos com hepatite crónica ativa, tumores hepáticos e IBD, motivou a investigação da sua capacidade de atravessar a barreira epitelial intestinal sob as nossas condições experimentais. Dados obtidos anteriormente no nosso grupo sugeriram que Hh é capaz de atravessar o epitélio intestinal em ratos B6 Ad.col, indicado pela presença de IgM (primeira Ig a ser produzida por células B maduras) e IgG (produzido mediante hipermutação somática após estimulação) específicos para Hh no seu soro. Por outro lado, tínhamos evidências de que a densidade de Hh nas fezes em ratos Rag2-/- Ad.col desprovidos de células B e T maduras (mutantes em que a função da enzima que participa na recombinação V(D)J está comprometida, tanto no locus de Ig como no receptor das células T) é maior do que em ratos B6 Ad.col. Assim, averiguámos se 1) a ausência do sistema imunitário adaptativo e 2) o período de colonização, alteram o tráfico de Hh para fora do epitélio intestinal. Para perceber se esta bactéria tem a capacidade de atravessar o epitélio nestas condições experimentais – em animais Rag2-/- Ad.col, B6 Ad.col e B6 Nb.col – a densidade de Hh em vários órgãos internos analisada por qPCR. A capacidade de Hh atravessar a barreira intestinal permaneceu indeterminada; embora tenha sido verificado um maior número de Hh nos MLN de ratos Rag2-/- Ad.col relativamente aos outros grupos, esta bactéria não foi detetada no fígado e baço em nenhum dos grupos analisados. Por outro lado, foram detetadas aproximadamente 10 cópias de 16S de Hh por ng de DNA do hospedeiro na GB de ratos B6 Nb.col, mas não em Rag2-/- ou B6 Ad.col. A cultura de Hh a partir dos diferentes órgãos internos referidos revelou-se necessária para confirmar ou esclarecer estes resultados. Finalmente, decidimos comparar o perfil inflamatório destes dois grupos numa situação de disrupção da barreira intestinal. Também investigámos se a colonização com Hh promove a progressão da resposta inflamatória no intestino, comparando estes grupos com animais SPF. Assim, o efeito da colonização com Hh numa situação de patologia intestinal foi analisado. Para replicar esta situação foi utilizado um modelo de colite induzida por DSS, avaliando a severidade da inflamação pela perda de peso corporal e pelos níveis de Lcn-2 nas fezes (ELISA) dos animais analisados (n=5 por grupo). Globalmente, uma relativa reprodutibilidade foi verificada entre as duas experiências realizadas independentemente. Como esperado, foi observada uma diminuição gradual do peso a partir do 4º dia do tratamento com DSS em ambas as experiências. No geral, a colonização com Hh não afetou o peso dos animais analisados até ao dia 9 (1 dia após ter sido removido DSS). Na primeira experiência, foi observada uma perda de peso constante até ao 11º dia em todos os grupos; porém, posteriormente, houve uma grande variação entre os ratos B6 Nb.col provocada por 2 animais, que apresentaram uma perda de peso mais drástica. Ainda assim, todos os animais voltaram a ganhar peso sensivelmente a partir dos 12º-13º dias, após o DSS ter sido removido, acabando por recuperar o peso inicial. Na segunda experiência, também foram detectadas algumas diferenças posteriormente ao 10º dia, embora num menor número de dias. Contudo, os níveis fecais de Lcn-2 não se correlacionaram com o do peso corporal: níveis elevados de Lcn-2 vs recuperação do peso inicial. A regeneração da mucosa intestinal bem como a manutenção da tolerância a Hh serão alvo de estudos futuros.Helicobacter hepaticus (Hh)-newborn colonization in B6 WT mice generates a tolerant response characterized by: undetectable faecal and serum Hh-specific IgA, high bacterial loads and maintenance of tolerance until adult life. In this study, monocolonization with this pathobiont revealed that this response is microbiota-independent. Moreover, we demonstrated that the specific Ig produced against Hh binds specifically to its surface. The niches inhabited by this microbe within the mouse GI tract were identified: higher Hh loads were found in the caecum followed by colon and ileum and, at lower number, in jejunum. In immunodeficient mice a high Hh load was found within the rectum. Hh ability to traverse the intestinal epithelial barrier remained uncertain as our data was unclear in this respect. Although a higher Hh load was estimated within MLN from immunodeficient Ad.col mice, it was not detected within the liver and spleen from any of the groups analysed. Still, we estimated around 10 copies of Hh 16S per ng of host DNA only within the GB from B6 Nb.col mice. Culture of Hh from the various internal organs is required to confirm these results. Finally, we investigated the effect of Hh colonization in the context of intestinal pathology. DSS-induced colitis was used to model intestinal disease, evaluating the severity of the inflammation. Generally, Hh colonization did not affect animal weight; however, the levels of faecal Lcn-2 did not correlate with body weight in both experiments: high Lcn-2 levels vs recovery of the initial weight. Mucosal healing and maintenance of tolerance to Hh will be subject for further work
