Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Imunologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014T cell differentiation involves the establishment of distinct transcriptomes that are preserved throughout cell divisions. Many inheritable changes in gene expression are not due to alterations in the DNA sequence (genes and regulatory elements) but rather attributed to epigenetic mechanisms. There are several layers of epigenetic regulation, from histone modifications that control gene loci accessibility, to microRNAs (miRNAs) that act posttranscriptionally to induce mRNA decay. Effector T cell subsets can be functionally distinguished by the signature cytokines they produce, and interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-17 (IL-17) are critical pro-inflammatory mediators in contexts of infection, cancer and autoimmunity. Among the various cellular sources of these two cytokines, it is now clear that innate-like gamma-delta (γδ) T cells are major providers especially at early stages of the immune response. Our laboratory has recently shown that murine γδ T cells contain two thymic-derived subsets, segregated on the basis of CD27 expression, that produce either IFN-γδ (CD27+) or IL-17 (CD27-). While the molecular mechanisms that control the production of these cytokines have been extensively studied in CD4+ T cells, they remain poorly understood for γδ T cells. As this is particularly notable concerning epigenetic mechanisms, these have been the major focus of my thesis. In the first part of my thesis, we conducted a genome-wide characterization of the methylation patterns of histone H3, along with analysis of mRNA encoding transcription factors, to identify the regulatory networks of peripheral IFN-γ-producing (γδIFNγ) or IL-17- producing (γδ17) γδ T cells. Given that these populations are present in lymphoid organs of naïve mice, we were able to analyse in vivo derived γδIFNγ (CD27+ ) or γδ17 (CD27-) cells. We found that CD27+ γδ cells are epigenetically committed to express Ifng but not Il17, whereas CD27- γδ cells spontaneously make IL-17 but can be induced to produce IFN-γ under specific inflammatory conditions in vitro and in vivo. This “plastic” behaviour of CD27- γδ cells associates with permissive histone H3 marks at loci encoding Ifng and upstream IFN-γ-driving transcription factors. By contrast, Il17 and related IL17-driving transcription factors are epigenetically and transcriptionally active in CD27- but silenced in CD27+ γδ cells. Hence, stable versus plastic behaviours of γδ cell subsets are controlled by integrated epigenetic and transcriptional mechanisms that regulate the expression of “master” transcription factors and effector cytokine genes. In the second part of my thesis, I explored another epigenetic level of gene regulation that is mediated by miRNAs. miRNAs are an evolutionarily conserved family of small non-coding RNAs that posttranscriptionally repress gene expression by targeting mRNA stability and/or blocking translation. Our analysis of T cell-specific miRNAdeficient mice (LckCre Dicer mice) revealed a global role of miRNAs in the differentiation of γδ T cells. Thus, we observed decreased numbers of γδ17 cells in the periphery (lymph node and spleen) and in the thymus of miRNA-deficient mice when compared to wild-type controls. To identify individual miRNAs implicated in γδ T cell differentiation, we undertook a transcriptome-wide analysis of miRNA expression in peripheral CD27+ and CD27- γδ T cell subsets and detected 35 differently expressed miRNAs. Based on the individual patterns of miRNA expression, we concentrated our analysis on miR-146a which was enriched in CD27- γδ T cells. We employed miR146a-deficient mice to investigate the impact of this miRNA on IL-17 and IFN-γ production by γδ T cells in naïve and parasite-infected mice. We detected a reduced frequency of γδ17 cells and an increased frequency of γδIFNγ cells in miR-146a-deficient mice during parasitic infections. Moreover, the retroviral-mediated over expression of miR-146a in wild-type γδ T cells led to a reduction in γδIFNγ cells. Therefore, miR-146a is the first miRNA shown to impact on γδ T cell differentiation. Future experiments will address the molecular mechanisms by which miR-146a controls IFN-γ and IL-17 expression in γδ T cells. Collectively, the data presented in this thesis provide novel insights into the epigenetic control of effector γδ T cell subsets that make key contributions to immune responses against infections and tumours, as well as to the pathogenesis of autoimmune diseases.A diferenciação de linfócitos T baseia-se no estabelecimento de transcriptomas específicos que se mantêm preservados através das várias divisões celulares. Muitas das alterações herdadas durante a expressão genética não são causadas por alterações ao nível da sequência do DNA (genes e elementos reguladores), surgindo na sequência de mecanismos epigenéticos. Existem várias etapas envolvidas na regulação epigenética, desde modificações de histonas que controlam a acessibilidade aos loci genéticos a microRNAs (miRNAs) que atuam a nível pós-transcricional, induzindo a degradação do mRNA. As subpopulações de células T efetoras distinguem-se funcionalmente pelas citocinas específicas que produzem. O interferão-gama (IFN-γ) e a interleucina-17 (IL-17) constituem exemplos de duas citocinas pro-inflamatórias, considerados mediadores críticos em contextos de infeção, cancro e autoimunidade. Sendo produzidas por vários tipos de células, tornou-se evidente que os linfócitos T gamma-delta (γδ) de tipo inato, constituem os principais produtores destas duas citocinas em estadios iniciais da resposta imunitária. O nosso laboratório mostrou recentemente que os linfócitos T γδ de ratinho possuem duas subpopulações distintas, segregadas com base na expressão de CD27, sendo uma produtora de de IFNγ (CD27+ ) e outra de IL-17 (CD27- ). Apesar dos mecanismos moleculares responsáveis pela regulação da produção destas citocinas se encontrarem bem descritos para os linfócitos T CD4 produzidos in vitro, permanecem ainda pouco caracterizados nos linfócitos T γδ. A minha tese incide sobretudo no estudo dos mecanismos epigenéticos subjacentes a estes processos, uma vez que a lacuna de conhecimentos moleculares é maior neste domínio específico. Na primeira parte da minha tese, efetuou-se a caracterização, através de estudos de larga escala, dos padrões de metilação da histona H3 bem como dos níveis de mRNA dos fatores de transcrição reguladores da expressão de IFNγ e IL-17. Estas experiências tiveram como objetivo identificar vias de regulação da produção de linfócitos T γδ produtores de IFNγ (γδIFNγ) ou IL-17 (γδ17). Tendo em conta que estas populações estão presentes nos órgãos linfoides de ratinhos “naïve”, foi possível analisar linfócitos T γδIFNγ (CD27+ ) ou γδ17 (CD27- ) in vivo. Chegou-se à conclusão que os linfócitos T γδ CD27+ estão condicionados, do ponto de vista epigenético, à expressão da citocina IFNγ mas não da IL-17, contrariamente aos linfócitos T γδ CD27- que produzem espontâneamente IL-17 mas podem também ser induzidos a produzir IFN-γ em condições inflamatórias específicas tanto in vitro como in vivo. Este comportamento “plástico” dos linfócitos γδ CD27- está associado à presença de marcas permissivas da histona H3 nos loci que codificam o Ifnγ e os fatores de transcrição responsáveis pela regulação da produção desta citocina. Contrariamente, o Il17 e os fatores de transcrição reguladores da expressão de IL-17 encontram-se epigenética e transcricionalmente ativos nos linfócitos T γδ CD27- mas silenciados nos linfócitos T γδ CD27+ . Pode então concluir-se que os fenótipos “estável” versus “plástico” das subpopulações de linfócitos T γδ são controlados por mecanismos epigenéticos e transcricionais que se encontram integrados e são responsáveis pela regulação da expressão de fatores de transcrição principais e de citocinas efectoras. Na segunda parte da minha tese, explorei a regulação da expressão genética por miRNAs que constitui um outro nível de regulação epigenética. Os miRNAs são, do ponto de vista evolutivo, uma família conservada de pequenos RNAs não codificantes que medeiam a inibição pós transcricional da expressão genética através do diminuição da estabilidade e/ou bloqueio da tradução de um dado mRNA. A análise de ratinhos deficientes para a produção de miRNAs especificamente em linfócitos T (ratinhos LckCre Dicer), demonstrou um papel global dos miRNAs sobre a diferenciação de linfócitos T γδ. Verificou-se uma diminuição da quantidade de linfócitos T γδ17 na periferia (nódulos linfáticos e baço) e no timo de ratinhos deficientes para a produção de miRNAs quando comparados com ratinhos controlo “wild-type”. Com o objectivo de identificar os miRNAs implicados na diferenciação dos linfócitos T γδ, efectuamos microarrays que permitiram a deteção de 35 miRNAs diferencialmente expressos nas subpopulações de linfócitos T γδ CD27- e CD27+ . Após análise dos padrões individuais de expressão destes miRNAs, optamos por incidir os estudos subsequentes num miRNA específico, o miR-146a, enriquecido nos linfócitos T γδ CD27- . A utilização de um modelo de ratinhos deficientes em miR-146a permitiu-nos investigar o impacto deste miRNA na produção de IL17 e IFN-γ pelos linfócitos T γδ em ratinhos naïve e ratinhos infetados com parasitas. Detetou-se uma redução da frequência de linfócitos T γδ17 e um aumento da frequência de linfócitos T γδIFNγ em ratinhos deficientes em miR-146a aquando da infeção por parasitas. Adicionalmente, estudos funcionais de sobre-expressão, mediada por retrovírus, do miR-146a em linfócitos T γδ “wild-type” demonstraram que este miRNA promove a diminuição do número de linfócitos T γδIFNγ. Identificou-se assim, neste estudo, o primeiro miRNA, miR-146a, envolvido no controlo da diferenciação de linfócitos T γδ. Serão ainda necessárias mais experiências a fim de estabelecer os mecanismos moleculares pelos quais o miR-146a controla a expressão do IFN-γ e IL-17 pelos linfócitos T γδ. No seu conjunto, os dados descritos nesta tese apresentam novas perspetivas ao nível do controlo epigenético de subpopulações de células T γδ efetoras, possuidoras de funções relevantes nas respostas imunes a infeções e tumores, bem como na patogénese de doenças autoimunes.European Research Council (ERC
