Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2012A transmissão inibitória desempenha um papel importante na regulação e estabilização da actividade neuronal e é essencial para diversas funções cerebrais como a cognição, percepção, movimento e emoção. As sinapses inibitórias, GABAérgica e glicinérgica, e a sua distribuição, apresentam diferenças no sistema nervoso central dos mamíferos (CNS). A maioria das sinapses inibitórias no cérebro são GABAérgicas, e as glicinérgicas, predominantes na espinal medula e tronco cerebral, tem sido bastante negligenciadas no cérebro.
A glicina exerce a sua função através do receptor ionotrópico da glicina (GlyR), um canal pentamérico composto por dois tipos de subunidades (α e β) permeável a iões cloreto e localizado na membrana do terminal pós-sináptico. Os transportadores da glicina 2 (GlyT2) pertencem à família de transportadores dependentes de Na+/Cl-. Estão presentes na membrana dos terminais pré-sinápticos glicinérgicos, assegurando a remoção da glicina da fenda sináptica e permitindo a inserção do neurotransmissor em vesículas sinápticas.
O presente estudo tem como principal objectivo investigar quais os principais intervenientes na aquisição do fenótipo glicinérgico.
Para isso, efectuou-se uma abordagem farmacológica, em culturas primárias de neurónios, com o propósito de avaliar o fenótipo glicinérgico mediante o comprometimento da transmissão GABAérgica. Os resultados obtidos por western blot e por PCR quantitativo (qPCR) revelaram que a expressão de GlyR e de GlyT2 aumentava significativamente, após tratamento das células com antagonistas do receptor ionotrópico de GABA GABAA (GABAAR) ou do transportador de GABA GAT-1, gabazina e SKF89976a, respectivamente. Em sinaptossomas obtidos de cérebro, a dupla detecção por imunofluorescência, de GlyT2 (marcador de neurónios glicinérgicos) e GAD (marcador de neurónios GABAérgicos) revelou igualmente que, na presença de SKF89976a, a razão entre terminais GABAérgicos e glicinérgicos se apresentava alterada. O comprometimento do sistema GABAérgico resultou no aumento de terminais glicinérgicos puros e mistos, com a consequente diminuição de terminais GABAérgicos. Neste trabalho, a interacção entre o transportador vesicular de aminoácidos inibitórios (VIAAT) e o GlyT2 foi igualmente explorada por ensaios de imunoprecipitação. Os resultados obtidos nesta tese evidenciam, pela primeira vez, que o comprometimento da neurotransmissão GABAérgica induz um aumento dos marcadores da transmissão mediada pela glicina, nomeadamente GlyR e GlyT2, sugerindo assim um mecanismo de compensação entre os dois sistemas inibitórios no cérebro.The inhibitory transmission plays an important role in the regulation and stabilization of brain network activity and is essential for a number of brain functions such as cognition, perception, movement and emotion. GABAergic and glycinergic inhibitory synapses, and their distribution, are very different in the mammalian central nervous system (CNS). Most inhibitory synapses in the brain are GABAergic, and glycinergic ones, predominant in the most caudal regions of the CNS, have been largely disregarded in the brain.
Glycine exerts its action through glycine receptors (GlyR), which belong to the superfamily of ligand-gated ion channels, are localized in the postsynaptic membrane and form pentameric channels composed of two different subunits (α and β) permeable to chloride ions. Glycine transporters 2 (GlyT2) belong to the family of Na+/Cl--dependent transporter proteins. They are located in the membrane of glycinergic neurons and are responsible for terminating glycine-mediated neurotransmission by uptaking glycine into glycinergic nerve terminals, allowing for neurotransmitter reloading of synaptic vesicles.
The present study aims to investigate which are the principal mediators for the acquisition of a glycinergic phenotype.
A pharmacological approach, in primary neuronal cultures, was pursued in order to evaluate the glycinergic phenotype upon a GABAergic transmission impairment. Western blot analysis and quantitative real-time PCR (qPCR) revealed that GlyR and GlyT2 expression increased significantly after treating the cultures with blockers for either GABAA receptor or GABA transporter GAT-1, gabazine and SKF89976a, respectively. In brain synaptosomes, double immunofluorescence of GlyT2 (marker of glycinergic neurons) and GAD (marker of GABAergic neurons) also revealed that, in the presence of SKF89976a, the ratio of GABAergic vs glycinergic terminals changed. GABAergic impairment caused an increase in mixed (GABA and glycine-containing) and pure glycinergic terminals, with a concomitant decrease in GABA-containing boutons. Furthermore, a physical interaction was assessed between Vesicular Inhibitory Amino Acid Transporter (VIAAT) and GlyT2 by immunoprecipitation assays.
These results obtained in this thesis have elucidated, for the first time, that impairment in GABA-mediated neurotransmission induces an increase in glycine- mediated transmission components, namely GlyR and GlyT2, and suggest a compensatory mechanism between the two inhibitory systems in the brain
