Tese de doutoramento, Farmácia (Tecnologia Farmacêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011The concept of pharmaceutical nanobiotechnology was originated in the 1970s when liposomes started to be used as nano-drug delivery systems (NanoDDS) to incorporate lipophilic and hydrophilic drugs. Since then liposomes have been the most widely investigated nano-carrier system aiming to achieve controlled drug delivery. The inability of several conventional therapies to deliver the therapeutic dose of the active agents to the diseased tissues at the desired time and concomitantly avoid causing severe toxic effects to healthy tissues or organs has brought considerable attention to the development and clinical use of NanoDDS.
In the work developed in this thesis we intended to use liposomes as NanoDDS for cytosolic delivery of bioactive agents aiming to target either diseases of the Mononuclear Phagocytic System (MPS) or cancer. Simultaneously we explored the flexibility and the multifunctional nature of liposomes in different aspects. Special attention was given on the potential of liposomes to carry new bioactive agents with distinctive physicochemical features: small molecules (anti-parasitic drugs) or macromolecules (oligonucleotides) and their ability to target different types of cells, such as macrophages (phagocytic cells) and tumour cells (non-phagocytic). In order to achieve our aims we chose two disease models: Leishmaniasis and Small Cell Lung Cancer (SCLC).
The development of liposomal formulations of dinitroanilines for the treatment of leishmaniasis was addressed in Chapter II. Dinitroanilines have proved in vitro anti-leishmanial activity but they are not used in clinical practice as chemotherapeutics for the treatment of leishmaniasis. Nevertheless, they hold great potential in the treatment of this disease due to a selective mechanism of action against parasite tubulins and to the absence of toxicity to mammals. To reach this aim we chose two complementary strategies. The first (Part A) consisted in the association of one dinitroaniline, trifluralin (TFL) with conventional liposomes. The second (Part B) consisted in the incorporation of chemical derivatives of TFL (TFL-D) prepared by organic chemistry hemi-synthesis methods, in order to further improve the chemical stability and biological activity. Conventional liposomes were used as solvents for these hydrophobic and difficult to handle dinitroanilines (either the TFL or the TFL-D) and also because they are naturally cleared from the circulation by the MPS favouring their choice to target intracellular infections of this system, such as leishmaniasis.
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In Part A, after achieving an efficient incorporation and stabilization of TFL in liposomal formulations (stability on storage up to 2 years in lyophilized form) their therapeutic activity in appropriated animal models of visceral and cutaneous leishmaniasis was evaluated. All TFL liposomal formulations were active against different strains of Leishmania, showing significant reduction in the levels of visceral and cutaneous infections in mice. A superior activity (at least 2-fold) was observed for liposomal TFL as compared to the free drug. A selected TFL liposomal formulation also improved the clinical condition of experimentally infected dogs and reduced the parasite load.
In Part B, two new dinitroaniline derivatives were used. This approach was pursued mainly to circumvent several disadvantages of TFL such as unfavourable physicochemical properties and difficulties on handling. Selected conventional liposomes were optimised for the incorporation of these TFL-Ds. The anti-leishmanial activity of TFL-D liposomal formulations was evaluated both in vitro and in vivo. The in vitro biological evaluation of the TFL-D liposomal formulations has demonstrated their activity against Leishmania parasites in culture without revealing signs of toxicity. In addition, extensive parasite load inhibition (> 90%) was observed after treatment with one of the TFL-D liposomal formulations in a murine model of zoonotic visceral leishmaniasis.
The use of liposomes as NanoDDS in cancer therapy was addressed in Chapter III. The association of conventional anti-cancer drugs with liposomes has been particularly investigated not only because it increases their concentration in the tumour tissue and reduces their negative side effects, but also because of the extensive application of gene therapy protocols in the treatment of cancer. In fact, antisense oligonucleotides (asODN) or other nucleic acid molecules are considered a new class of anti-cancer drugs since they are able to selectively inhibit the expression of a gene. They act by binding to a complementary region of the mRNA causing its degradation with the consequent down-regulation of the corresponding protein. However, nucleic acids molecules need adequate NanoDDS to be efficiently delivered into the cytosol of the tumour cells due to their poor stability in physiological fluids, high susceptibility to nuclease degradation and limited ability to penetrate through cellular membranes. Based on this rationale, Chapter III is focused on the development of a targeted-liposome delivery system containing an asODN for the treatment of SCLC. For this purpose, long circulating (PEG-grafted) cationic liposomes were used for the encapsulation of the asODN. The attachment of a targeting ligand for selective
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cellular delivery, on the outer surface of this long circulating formulation, makes it a specific delivery system for SCLC cells. Two different cationic liposomal formulations, Coated Cationic Liposomes (CCL) and Stabilized Antisense Lipid Particles (SALP), were selected for the encapsulation of an asODN that inhibits the expression of c-myc oncogene, associated with SCLC cell proliferation. The hexapeptide antagonist G was chosen as the targeting ligand to promote internalization of these formulations. The effect of the peptide coupling method, conventional and post-insertion, on the loading capacity and size of both formulations was assessed. The post-insertion coupling method applied both to CCL and SALP liposomes containing as(c-myc), developed in Chapter III resulted in antagonist G-targeted formulations with the necessary characteristics for evaluation of in vitro delivery of asODN to SCLC. The strategy of using antagonist G as the targeting ligand proved to be successful as it increased the uptake of both formulations as compared to the non-targeted counterparts, in particular in a variant SCLC cell line characterised by being resistant to conventional chemotherapy. The presence of the antagonist G at the surface of SALP did not affect the long circulation characteristics of the SALP liposomes as shown in pharmacokinetic studies. In addition, the preferential accumulation of this formulation in the lungs, substantiate the rationale behind the design of these targeted liposomes for in vivo intracellular delivery of nucleic acids.
Overall, the main objectives of this work were reached. Throughout its experimental development new and important issues were identified and remain open. These issues may be an interesting starting point for future research.O conceito de nanobiotecnologia no campo farmacêutico teve a sua origem na década de 1970 quando os lipossomas foram, pela primeira vez, utilizados como sistemas de transporte e entrega de fármacos (NanoDDS, do inglês Nano Drug Delivery Systems) para a incorporação quer de moléculas hidrófobas quer hidrófilas. Desde essa altura e tendo como objectivo a entrega de fármacos de forma controlada, os lipossomas têm sido os sistemas de transporte in vivo mais estudados. O desenvolvimento de NanoDDS tem sido alvo de grande interesse como alternativa a algumas terapias convencionais nos casos em que se demonstra incapacidade de entrega da dose terapêutica de fármacos nos seus locais de acção e em tempo útil, sem que se verifiquem, em simultâneo efeitos adversos nos tecidos sãos.
O trabalho aqui desenvolvido refere-se à concepção e desenvolvimento de nano-formulações, via incorporação em lipossomas, para transporte intracelular de agentes bioactivos não convencionais e de natureza diversa, quer nas suas características físico-químicas, quer nos alvos terapêuticos a que se destinam: moléculas de baixo peso molecular, comercializadas ou obtidos por hemi-síntese, dirigidas a macrófagos infectados por Leishmania e uma macromolécula (oligonucleótido) destinada a células do cancro das pequenas células do pulmão (SCLC, do inglês Small Cell Lung Cancer).
O Capítulo II refere-se ao desenvolvimento de formulações lipossomais de dinitroanilinas para o tratamento da leishmaniose. As dinitroanilinas são uma nova classe de compostos que, embora evidenciem actividade anti-parasitária, não fazem parte da prática clínica do tratamento desta doença. No entanto, possuem um mecanismo de acção selectivo nas tubulinas dos parasitas que, juntamente com ausência de toxicidade para os mamíferos, lhes conferem grande potencial como fármacos leishmanicidas. Para atingir este objectivo foram utilizadas duas abordagens complementares, a primeira das quais (Parte A) consistiu na incorporação de uma dinitroanilina, a trifluralina (TFL), em lipossomas convencionais. A segunda abordagem (Parte B) consistiu na incorporação em lipossomas de moléculas hemi-sintéticas derivadas da TFL (TFL-D). Esta estratégia teve como objectivo melhorar a estabilidade química e a actividade biológica da TFL. Os lipossomas convencionais foram utilizados como solventes para as dinitroanilinas (TFL e TFL-D), que são compostos hidrofóbicos e de difícil manuseamento. Além disso e uma vez que este tipo de lipossomas é
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naturalmente eliminado da circulação sanguínea através do sistema fagocitário mononuclear (MPS, do inglês Monoculear Phagocytic System) a sua utilização para o tratamento de infecções de células e órgãos desse sistema, tal como a leishmaniose, parece pertinente.
Na Parte A deste estudo, foram obtidas formulações lipossomais de TFL com elevada estabilidade (até 2 anos na forma liofilizada) e que apresentam parâmetros de incorporação apropriados. Estas formulações foram avaliadas em termos da sua actividade terapêutica em modelos animais de infecção de leishmaniose visceral e cutânea (Leishmania donovani e L. major). Observou-se uma acentuada redução dos níveis de infecção nos animais tratados com as formulações lipossomais de TFL, as quais demonstraram ser, pelo menos, 2 vezes superiores à do fármaco na forma livre. Do mesmo modo, verificou-se uma acentuada melhoria do quadro clínico, devida à grande redução da carga parasitária em cães experimentalmente infectados com leishmaniose e tratados com uma formulação lipossomal de TFL.
Na Parte B deste trabalho foram utilizados dois novos derivados da TFL. Esta abordagem constitui uma forma de ultrapassar as propriedades físico químicas da TFL, tais como a sua baixa solubilidade aquosa e a dificuldade de manuseamento deste fármaco. Após optimização das formulações de lipossomas convencionais contendo dois TFL-D foi avaliada a sua actividade leishmanicida quer em ensaios in vitro quer em modelos animais. A avaliação biológica in vitro das formulações lipossomais de TFL-D demonstrou serem activas contra parasitas de Leishmania em cultura, sem revelarem sinais de toxicidade em relação a culturas de células de mamífero. Por outro lado, em estudos num modelo animal de leishmaniose visceral zoonótica, foi observada uma elevada redução (> 90%) da carga parasitária após tratamento com estas mesmas formulações.
A utilização de NanoDDS tem sido investigada com particular interesse no tratamento do cancro, com o objectivo de a associação de fármacos anti-tumorais com lipossomas possa aumentar a concentração daqueles no tecido tumoral, reduzindo simultaneamente, a sua acumulação em tecidos normais. Esta estratégia tem sido seguida não só com fármacos anti-tumorais convencionais como também e com maior incidência nas últimas décadas, em protocolos de terapia génica. De facto moléculas como os oligonucleótidos antisentido (asODN, do inglês antisense oligonucleotides) ou outros ácidos nucleicos são considerados uma nova classe de fármacos anti-tumorais uma vez que são capazes de inibir a expressão de um gene. Os asODN actuam através da ligação a uma região complementar de um determinado mRNA provocando a sua
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degradação e consequente inibição da expressão da proteína correspondente. No entanto, para os ácidos nucleicos atingirem os seus alvos intracelulares necessitam de NanoDDS uma vez que são pouco estáveis em fluidos biológicos, apresentam uma elevada susceptibilidade à degradação por nucleases e não atravessam facilmente as membranas biológicas. Assim o Capítulo III refere-se ao desenvolvimento de formulações lipossomais apropriadas para a encapsulação de asODN e direccionadas por ligandos acoplados à superfície. Neste sentido, foram utilizados lipossomas catiónicos de longo tempo de circulação aos quais foi acoplado um ligando capaz de promover a internalização celular selectiva deste sistema por parte das células do SCLC. Dois tipos de lipossomas catiónicos designados por CCL (do inglês Coated Cationic Liposomes) e SALP (do inglês Stabilized Antisense Lipid Particles) foram seleccionados para a encapsulação de um asODN, designado por as(c-myc) que inibe a expressão do oncogene c-myc, associado à elevada proliferação celular que caracteriza o SCLC. O ligando responsável pelo direccionamento e internalização utilizado foi o hexapéptido designado por antagonista G. Dois métodos de acoplamento do péptido (convencional e pós-inserção) foram comparados e foi avaliado o efeito de cada um em parâmetros como a eficácia de encapsulação e o tamanho médio dos lipossomas. Os lipossomas CCL e SALP direccionados com o antagonista G possuem as características necessárias para a avaliação da entrega de as(c-myc) a células de SCLC em cultura. A estratégia da utilização do antagonista G como ligando para a entrega dirigida de as(c-myc) mostrou um aumento da internalização de ambas as formulação, em particular no caso de uma linha celular de SCLC caracterizada por ser resistente a fármacos convencionais. Por outro lado, a presença do antagonista G à superfície dos SALP não afectou negativamente as características de longo tempo de circulação no sangue apresentadas por esta formulação. Para além disso, a acumulação preferencial desta formulação direccionada nos pulmões, sustenta esta estratégia de desenho de sistemas especificamente dirigidos para a entrega intracelular de ácidos nucleicos neste órgão.
Dum modo geral, os principais objectivos deste trabalho foram atingidos. Ao longo do seu desenvolvimento experimental novas e importantes questões foram identificadas que permanecem em aberto e que constituem um ponto de partida interessante para trabalhos futuros
