Pneumococcal invasive disease in adults (2015-2017) : epidemiological and molecular characterization of Streptococcus pneumoniae and genomic analysis of emerging clones

Abstract

Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020The introduction of the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV13) for children in Portugal resulted in significant changes in the serotype distribution of the pneumococcal population responsible for invasive pneumococcal disease (IPD) not only in children, but also in adults, consistent with herd protection. A 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine (PPV23) is also available in Portugal since 1996, although adult uptake is believed to be low. The effect of broader PCV13 uptake in children in adult IPD is currently unknown. We aimed to characterize the pneumococcal population causing adult IPD (≥18 years old) in Portugal after the introduction of PCV13 in the Nacional Immunization Plan for children, in 2015. A total of 1608 Streptococcus pneumoniae isolates were recovered from adult IPD in 61 hospitals in Portugal between 2015 and 2017. These strains were characterized phenotypically (serotyping and antimicrobial susceptibility testing) and by molecular methods (MLST). The results obtained were compared with those from previous studies to assess the effect of PCV13 introduction in Nacional Immunization Plan in the studied population. Among the 1608 isolates, 56 different serotypes were found. The most common serotypes were serotype 8 (17.8%, n=287), 3 (14.7%, n=236), 22F (7.4%, n=119), 14 (6.9%, n=111), 19A (6.2%, n=100) and 9N (4.1%, n=66). Most of the cases corresponded to serotypes exclusively found in the PPV23 (42.4%, n=681). The PCV13 serotypes were responsible for 37.6% (n=605) of the cases, and 7-valent pneumococcal conjugate vaccine (PCV7) serotypes accounted for a small fraction of the cases (14.0%, n=225). Penicillin and erythromycin non-susceptibility were detected in 14.9% (n=239) and 16.4% (n=263) of the bacterial isolates, respectively. PCV7 and serotypes exclusively found in PCV13 were responsible for 51.0% (n=122) and 15.5% (n=37) of the penicillin non-susceptible isolates and 37.6% (n=99) and 19.0% (n=50) of the erythromycin resistant isolates, respectively. Regarding all collection, 31.2% (n=501) of the strains were non-susceptible to at least one of the tested antibiotics, where serotypes 14 and 19A were the most common. MLST analysis was performed in 726 strains, where 56 different clonal complexes were found. PCV13 serotypes presented a high genetic diversity, while serotypes exclusively found in PPV23 and non-vaccine serotypes (NVT) presented a lower genetic diversity. Thirteen major clonal complexes (CC) were defined in this study that accounted for 86.4% (n=627) of the isolates: CC156, CC180, CC433, CC378, CC97, CC235, CC439, CC199, CC260, CC315, CC994, CC30 and CC191. Eleven of the 43 PMEN clones were at least double-locus-variant of 33.6% (n=244) of the isolates, however no significant association was established between clonal complexes and penicillin and erythromycin non-susceptible isolates. Serotyping was also performed using in silico methods, where both approaches (SeroBa and PneumoCAT) were found to be good alternatives to conventional methods for the determination of S. pneumoniae serotypes. Comparison with previous studies revealed an increase in the proportion of serotypes 8 and 12F, while serotypes 1, 12B and 7F decreased. Non-susceptible serotypes 8 and 22F isolates increased, whereas non-susceptible 19A isolates decreased. Although not significant, serotype 3 also presented an increase in the proportion of non-susceptible isolates to some of the antimicrobials tested. Regarding genetic lineages, sequence type (ST) 53 (serotype 8) increased, while ST191 (serotype 7F) and ST276 (serotype 19A) decreased. Even with the introduction of PCV13 in the National Immunization Plan, serotype 3 is still one of the dominant serotypes in adult IPD in Portugal, along with serotypes 14 and 19A (all serotypes present in PCV13). The increase in serotypes that do not belong to PCV13, especially serotype 8, 22F and 9N is also of concern, particularly serotypes 8 and 22F where antimicrobial non-susceptible isolates increased. With these, our data suggests that, in a situation of higher vaccination coverage, PCV13 serotypes are still significant causes of adult IPD, especially serotypes 3. However, serotypes not present in PCV13 have been showing to be an important cause of adult IPD, particularly serotypes 8 and 22F, reinforcing the continuous need for surveillance studies.Streptococcus pneumoniae é um dos agentes patogénicos mais comuns do ser humano, responsável por elevadas taxas de mortalidade e morbilidade. Este microrganismo coloniza, tipicamente, a nasofaringe das crianças, podendo tornar-se patogénico, levando ao desenvolvimento de doenças pneumocócicas invasivas como a pneumonia, meningite e bacteriemia, ou não invasivas como otite média ou sinusite. Tem como principais grupos de risco crianças, indivíduos imunocomprometidos e idosos. Com a introdução das vacinas pneumocócicas conjugadas, observou-se um decréscimo na incidência da doença pneumocócica invasiva em crianças, assim como alterações na distribuição dos serotipos, também na população adulta. Este decréscimo deveu-se sobretudo à redução da incidência dos serotipos incluídos nestas vacinas. Contudo, observou-se um aumento na proporção de serotipos não vacinais, assim como a persistência de alguns serotipos vacinais (como foi o caso do serotipo 3 que se encontra presente na vacina pneumocócica conjugada 13-valente). A vacina pneumocócica conjugada 7-valente (PCV7, inclui os serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) foi introduzida em Portugal em 2001. Apesar de disponível apenas no sector privado, a cobertura desta vacina foi aumentado gradualmente ao longo dos anos, tendo-se estimado uma cobertura vacinal de 75% das crianças com ≤2 anos em 2008. Tal como nas crianças, nos adultos observou-se uma redução da proporção de doença pneumocócica invasiva causada por serotipos abrangidos pela vacina PCV7. No entanto, os serotipos 1, 3, 7F e 19A emergiram como causas importantes de doença pneumocócica invasiva nos adultos pós-PCV7 (estudo de 2006 a 2008). Em meados de 2009, a vacina pneumocócica conjugada 10-valente (PCV10, engloba todos os serotipos presentes na vacina PCV7, mais os serotipos 1, 5 e 7F) ficou disponível, seguindo-se em 2010 a disponibilização da vacina pneumocócica conjugada 13-valente (PCV13, abrange todos os serotipos presentes na vacina PCV10, mais os serotipos 3, 6A e 19A), ambas no sector privado. A introdução desta última vacina em Portugal resultou numa alteração da distribuição dos serotipos da população de S. pneumoniae responsáveis por doença pneumocócica invasiva em adultos, apesar de estes permanecerem como importantes causas de doença pneumocócica invasiva nos adultos, consistente com o efeito de proteção de grupo. A vacina pneumocócica polissacarídica 23-valente (PPV23, integra todos os serotipos presentes na vacina PCV13, à exceção do serotipo 6A, mais os serotipos 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F e 33F) encontra-se disponível em Portugal desde 1996, ainda assim estima-se que a cobertura desta vacina seja baixa. Em 2015, a vacina PCV13 foi introduzida no plano nacional de vacinação das crianças, esperando-se, deste modo, uma maior cobertura vacinal, o que pode levar a alterações na população deste microrganismo causador de doença pneumocócica invasiva em criança e, consequentemente, em adultos. Assim, este estudo teve como objetivo caracterizar a população de Streptococcus pneumoniae causadora de doença invasiva pneumocócica nos adultos (indivíduos com ≥18 anos) em Portugal, após a introdução da vacina PCV13 no plano nacional de vacinação para as crianças em 2015. Um total de 1608 estirpes de Streptococcus pneumoniae responsável por doença invasiva pneumocócica em adultos foram recebidas por 61 hospitais de todo o país entre 2015 e 2017. Estas estripes foram caracterizadas fenotipicamente (através de serotipagem e teste de suscetibilidade aos antimicrobianos) e genotipicamente (através de métodos moleculares, obtendo-se o perfil de multilocus sequence typing por sequenciação total do genoma). Os resultados obtidos foram ainda comparados com os de estudos anteriores, de forma a avaliar o efeito da introdução da vacina PCV13 no plano nacional de vacinação na população em estudo. De entre as 1608 estirpes de pneumococos, foram encontrados 56 serotipos diferentes, sendo que os mais frequentes foram os serotipos: 8 (17.8%, n=287), 3 (14,7%, n=236), 22F (7,4%, n=119), 14 (6,9%, n=111), 19A (6,2%, n=100) e 9N (4,1%, n=66). Grande parte dos casos pertenceram a serotipos exclusivos da vacina PPV23 (42,4%, n=681). Os serotipos da vacina PCV13 foram responsáveis por 37,6% (n=605) dos casos em estudo, sendo que serotipos da vacina PCV7 foram responsáveis por uma pequena fração dos casos em estudo (14,0%, n=225). A não suscetibilidade à penicilina e à eritromicina foi detetada em 14,9% (n=239) e 16,4% (n=263) das estirpes estudadas, respetivamente. Serotipos da vacina PCV7 e serotipos exclusivos da vacina PCV13 foram responsáveis por 51,0% (n=122) e 15,5% (n=37) dos casos de não suscetibilidade à penicilina e 37,6% (n=99) e 19,0% (n=50) dos casos de resistência à eritromicina, respetivamente. Em relação à coleção total de estirpes, 31,2% (n=501) das estirpes apresentaram não suscetibilidade a pelos menos um dos antimicrobianos testados, onde os serotipos 14 e 19 foram os mais comuns. A analise dos perfis de multilocus sequence typing foi realizada em 50% das estipes que apresentaram mais do que 10 estirpes do mesmo serotipo, tendo-se obtido um total de 726 estirpes sequenciadas, onde foram detetados 56 complexos clonais diferentes. Serotipos da vacina PCV13 apresentaram uma elevada diversidade genética, enquanto que os serotipos exclusivos da vacina PPV23 e serotipos não vacinais apresentaram uma diversidade genética baixa. Treze complexos clonais principais foram definidos neste estudo, englobando 86,4% (n=627) das estirpes sequenciadas: complexo clonal (CC) 156, CC180, CC433, CC378, CC97, CC235, CC439, CC199, CC260, CC315, CC994, CC30 e CC191. Onze dos 43 clones PMEN foram identificados como sendo, pelo menos, double-locus-variants de 33,6% (n=244) das estirpes sequenciadas. No entanto, não se estabeleceu nenhuma associação significativa, depois da correção para testes múltiplos, entre complexos clonais e não suscetibilidade à penicilina e à eritromicina. Determinaram-se, ainda, os serotipos através de métodos in silico, onde se observou que ambos os softwares SeroBa e PneumoCAT são boas alternativas aos métodos convencionais para a determinação dos serotipos de S. pneumoniae. Em relação à analise comparativa com estudos anteriores, observou-se um aumento na proporção dos serotipos 8 e 12F, ao passo que os serotipo 1, 12B e 7F apresentaram um decréscimo significativo. A proporção de serotipos 8 e 22F não suscetíveis a antimicrobianos aumentou quando comparada com a proporção do estudo anterior, enquanto que a proporção de serotipo 19A não suscetível a antimicrobianos diminuiu significativamente. Apesar de não significativo após a correção para testes múltiplos, o serotipo 3 também apresentou um aumento na sua proporção de estirpes não suscetíveis a determinados antimicrobianos testados. Em relação à analise comparativa das linhagens genéticas, sequence type (ST) 53 (constituído maioritariamente por estirpes do serotipo 8) aumentou em proporção, ao passo que os ST191 (constituído sobretudo por estirpes do serotipo 7F) e ST276 (constituído principalmente por estirpes do serotipo 19A) diminuíram, todos de modo significativo. Deste modo, observou-se que mesmo com a introdução da vacina PCV13 no plano nacional de vacinação, o serotipo 3 continua a ser um dos serotipos mais frequente como causa de doença invasiva pneumocócica em adultos em Portugal, juntamente com os serotipos 14 e 19A (todos estes serotipos estão presentes na vacina PCV13). O aumento da proporção de serotipos não abrangidos pela vacina PCV13, nomeadamente os serotipos 8, 22F e 9N, são de especial preocupação, principalmente o caso dos serotipos 8 e 22F onde se observou um aumento na proporção de estirpes não suscetíveis a antimicrobianos. Assim, podemos concluir com este estudo que numa situação de elevada cobertura vacinal, os serotipos da vacina PCV13 ainda são causas importantes de doença pneumocócica invasiva nos adultos, em particular o serotipo 3. Contudo, os serotipos não abrangidos por esta vacina têm-se mostrado, também, relevantes causas de doença pneumocócica invasiva em adultos em Portugal, especialmente os serotipos 8 e 22F, reforçando desta forma a continua necessidade de realizar estudos de vigilância epidemiológica