Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021Alzheimer's disease (AD) is a chronic and progressive neurodegenerative disease, considered the most common cause of dementia in the elderly population. Its rapid progression makes the quality of life of patients and their relatives/caregivers devastating. In addition, AD economic impact is very significant, as trillions of dollars are spent each year in disease care. Since its discovery in 1907, AD has been intensively studied, but no cure or effective preventive strategy has yet been discovered. At the cellular level this pathology is characterized by loss of synapses, neuronal death, intracellular neurofibrillary aggregates of Tau phosphorylated protein and extracellular peptide β amyloid (Aβ) deposition. However, several aspects of this disease are still unknown, such as the mechanisms of neuronal death induced by Aβ. Recently AD has been associated with inflammatory events, in particular the activation of a multiprotein cytoplasmic complex, NLRP3 inflammasome. This complex is involved in the activation of Caspase-1 and subsequent production of pro-inflammatory cytokines such as Interleukine-1β (IL-1β) and IL-18, and cleavage of Gasdermin D (GSDMD), associated with pyroptosis, a type of inflammatory cell death. Several studies have suggested a diarylsulfonylurea-containing small molecule, named MCC950, as a potent and selective NLRP3 oligomerization inhibitor, that does not affect the role of other inflammasomes, hence avoiding immunosuppressive effects. This project has three main objectives: 1) to establish a model of Aβ-induced toxicity in acute slices, 2) to characterize the Aβ-induced neuroinflammatory milieu in this system, and 3) to evaluate the potential protective effect of MCC950 upon Aβ impact. The work was performed in acute slices of hippocampus extracted from 7 to 8 weeks old Wistar rats, which were subsequently exposed to Aβ1-42 oligomers. Western Blot assays and Enzyme Linked Immunosorbent Assay were used to evaluate glial activation, and inflammasome priming and oligomerization. Afterwards, the effect of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 was addressed, to check whether it was capable or not to prevent the Aβ1-42-induced noxious effects. Indeed, our results show that Aβ1-42 oligomers triggered the reactive phenotypes of astrocytes and microglia, in a process known as reactive gliosis, and induced inflammasome priming and activation, causing increased expression of Caspase-1 and Caspase-1-mediated processing of IL-1β, as well as the expression of the cleaved form of GSDMD, known to oligomerise in the inner side of the cell membrane, creating pores typical of cellular death by pyroptosis. On the other hand, MCC950 prevented inflammasome priming and activation and its respective correlates, namely, it decreased reactive gliosis and the expression of inflammasome-driven events, as production of active Caspase-1 and cleaved GSDMD. However, as MCC950 does not affect the inflammasome priming step, it did not influence the Aβ1-42-induced increased expression of NLRP3 protein and IL-1β. Their expression continues increased in the presence of MCC950 due to the induction of the NF-κB pathway by the Aβ1-42 oligomers. Overall results show that Aβ1-42 oligomers induce a powerful neuroinflammatory context in acute hippocampal slices, mediated by NLRP3 inflammasome, and reinforce the hypothesis that Aβ1-42 toxic species eventually lead to cellular death by pyroptosis. Moreover, this work highlighted the role of MCC950 as an effective NLRP3 inflammasome inhibitor, further strengthening its potential as a drug for AD.A doença de Alzheimer (Alzheimer’s Disease - AD) é uma doença neurodegenerativa crónica e progressiva, considerada a causa mais comum de demência na população idosa. A sua rápida progressão torna devastadora a qualidade de vida dos doentes e dos seus parentes/cuidadores. Além disso, o impacto económico da AD é muito significativo, uma vez que triliões de dólares são gastos todos os anos no tratamento da doença. Atualmente, a ideia de um fármaco único para AD é considerada utópica. À medida que o conhecimento sobre a doença aumenta, mais investigadores se apercebem de que esta é de facto consequência de uma complexa cascata de eventos com muitas redes de interações. Por esta razão, é mais provável que um tratamento futuro possa surgir de combinações de diferentes fármacos que visem pontos de controlo cruciais no desenvolvimento da doença. Desde a sua descoberta em 1907, a doença tem sido intensamente estudada, embora ainda não tenha sido descoberta nenhuma cura ou estratégia eficaz de prevenção. A nível celular, esta patologia é caracterizada pela perda de sinapses, morte neuronal, agregados neurofibrilares intracelulares de proteína Tau fosforilada e deposição extracelular do péptido β amilóide (Aβ). No entanto, vários aspetos desta doença são ainda desconhecidos, tais como os mecanismos de morte neuronal induzida por Aβ. Este trabalho baseia-se na hipótese da cascata amilóide, que considerando dados genéticos e histopatológicos, sugere que depósitos tóxicos de Aβ no cérebro desencadeia uma sequência de eventos que culminam na ativação crónica das células gliais (gliose) criando um ambiente neuroinflamatório, danificando progressivamente os neurónios, alterando a homeostase iónica, aumentando o stress oxidativo e causando eventualmente a morte generalizada das células. O hipocampo é surpreendentemente suscetível a insultos, sendo uma das áreas do cérebro mais afetadas por patologias relacionadas com o envelhecimento, como a AD. De facto, várias evidências sugerem que é a primeira região do cérebro a apresentar sinais de neurodegeneração, bem como consequentes alterações estruturais, especialmente perda de volume. Recentemente, a AD tem sido associada a eventos inflamatórios, especificamente a inflamassomas, complexos multiproteicos citosólicos que medeiam respostas imunes. Vários inflamassomas foram descritos, no entanto, o inflamassoma NLRP3 é o mais intensivamente estudado, sendo a sua ativação reconhecida como um componente central no desenvolvimento de várias doenças inflamatórias e autoimunes. Foi observada uma ativação exacerbada da via do NLRP3 nas doenças cerebrais e alguns estudos sugerem que este inflamassoma desempenha um papel fundamental na disfunção comportamental e cognitiva observada na AD, pelo que a sua inibição pode resultar em efeitos terapêuticos e/ou preventivos significativos. Este complexo está envolvido na ativação da Caspase-1 e subsequente produção de citocinas pró-inflamatórias como a Interleucina-1β (IL-1β) e a IL-18, e processamento da Gasdermin-D (GSDMD), associada à morte celular por piroptose. A piroptose é um tipo de morte celular programada, dependente da ativação de caspases inflamatórias, tais como a Caspase-1. Estudos recentes mostraram que a piroptose está associada a uma variedade de doenças neurodegenerativas devido ao seu efeito pró-inflamatório e disfunções celulares relacionadas. Morfologicamente, a piroptose é caracterizada pela formação de poros na membrana plasmática, levando à libertação de citocinas inflamatórias e outros sinais de stress celular, perpetuando assim o efeito inflamatório. A Caspase-1 promove a clivagem da proteína GSDMD, formando-se o fragmento N-terminal (GSDMD-NT), que é subsequentemente translocado para o interior da membrana plasmática, onde se conecta aos fosfatos fosfatidilinositol e fosfatidilserina, oligomerizando e originando poros. As células gliais consistem em macroglia, tais como astrócitos e oligodendrócitos, e microglia. Destas, as microglias são consideradas os macrófagos do cérebro, embora atualmente se saiba que os astrócitos também têm um papel crucial nas respostas imunitárias do sistema nervoso central. As células gliais possuem recetores de reconhecimento de padrões, como NLRP3, capazes de detetar sinais de stress ou derivados de patógenos. Existem duas principais vias de ativação do inflamassoma NLRP3: a via canónica e a via não canónica. A primeira, sobre a qual este trabalho incide, requer um sinal de priming e um sinal de ativação ou oligomerização. Nos últimos anos, vários estudos têm enaltecido o potencial de um composto, MCC950, considerado um potente e seletivo inibidor de oligomerização do inflamassoma NLRP3, que não afeta o papel de outros inflamassomas, como o NLRP1, evitando assim efeitos imunossupressores. Este projeto tem três objetivos principais: 1) estabelecer um modelo de toxicidade induzida por Aβ em fatias agudas de hipocampo, 2) caracterizar o meio neuroinflamatório induzido por Aβ, e 3) avaliar o potencial efeito protetor do MCC950 sobre o impacto de Aβ. O estudo foi realizado em fatias agudas de hipocampo obtidas de ratos Wistar com idades compreendidas entre 7 a 8 semanas, que foram subsequentemente expostas a oligómeros de Aβ1-42. Os ensaios de Western Blot (WB) e de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) foram utilizados para avaliar a ativação glial, as etapas de priming e oligomerização do inflamassoma, e a ocorrência de morte por piroptose. Posteriormente, foram avaliados os efeitos do inibidor do inflamassoma NLRP3, MCC950, para verificar a sua capacidade de contrariar os efeitos nocivos induzidos por Aβ1-42. Os nossos resultados indicam que Aβ1-42 induziu o priming e a ativação do inflamassoma NLRP3, desencadeando consequentemente o fenótipo reativo de astrócitos e microglia, num processo conhecido como gliose, e aumentando a produção de IL-1β, bem como a expressão da forma clivada de GSDMD, conhecida por migrar para o lado interno da membrana celular, criando poros e conduzindo a morte celular por piroptose. Por sua vez, o inibidor seletivo do inflamassoma NLRP3, MCC950, impediu a ativação do inflamassoma e o seu impacto, diminuindo a gliose, e a expressão da Caspase-1 ativa e da GSDMD clivada. Contudo, uma vez que o MCC950 não afeta a etapa de priming do inflamassoma, as expressões das proteínas NLRP3 e IL-1β não foram influenciadas, continuando aumentadas na presença do inibidor devido à ativação da via NF-κB pelos oligómeros de Aβ1-42. Os níveis de Caspase-1 e GSDMD-NT foram reestabelecidos na presença de MCC950, confirmando que o inibidor impediu a oligomerização do inflamassoma, afetando a conversão da pro-Caspase-1 em Caspase-1 ativa, e consequentemente a clivagem da GSDMD. Finalmente, os níveis do domínio ASC, inalterados pelos oligómeros de Aβ1-42, não sofreram alterações na presença do MCC950. Com a oligomerização do inflamassoma impossibilitada, o processamento e libertação de citocinas pró-inflamatórias ficaram comprometidos. Por esta razão, na presença do MCC950 é inibida a ativação da via NF-κB em astrócitos e prevenida a conversão para o fenótipo neurotóxico A1. O MCC950 não só impediu a ocorrência de astrogliose, como também a ativação da microglia. Os resultados revelaram que o MCC950 conduziu à diminuição significativa da expressão do marcador de microglia reativa CD68, induzida pelos oligómeros de Aβ1-42. Sumariamente, os resultados deste trabalho demonstram que Aβ1-42 induz uma poderosa resposta neuroinflamatória, mediada pelo inflammasoma NLRP3, e reforçam a hipótese de que os oligómeros tóxicos de Aβ originam a morte celular por piroptose. Além disso, foi realçado o papel do MCC950 como um inibidor eficaz do inflamassoma NLRP3, capaz de impedir os efeitos da sua ativação e reforçando assim o seu potencial terapêutico. Avanços científicos recentes relativos ao desenvolvimento de técnicas não invasivas para a deteção in vivo de depósitos de Aβ, permitem que a doença seja detetada antes de esta se começar a manifestar. Neste contexto, a administração preventiva de MCC950 poderá ser decisiva para impedir a perda celular causada por processos inflamatórios nocivos, evitando, consequentemente, o aparecimento de sintomas. À medida que o conhecimento sobre a doença aumenta, mais claro é o facto de que AD é resulta de uma complexa cascata de eventos com muitas redes de interações. Por esta razão, é provável que uma abordagem farmacológica futura surja da combinação de diferentes medicamentos que visem pontos de controlo cruciais para o desenvolvimento da doença
