Comparing of Experimental Approaches of Biodosimetric Methods

Abstract

Tato práce se zabývá srovnáním dvou biodozimetrických metod sloužících ke zpětnému odečtu obdržené dávky ionizujícího záření. Cílem práce je porovnat výsledky získané měřením pomocí standardního cytogenetického testu a nového experimentálního přístupu, který umožňuje efektivní kvantifikaci zlomů DNA v jádře periferních lymfocytů pomocí proteinu gama H2AX. V teoretické části jsou popsány biologické účinky ionizujícího záření, druhy záření s jejich následným rozdělením do podskupin a jejich vlastnosti. Dále se v práci popisuje vztah dávky a účinku, deterministické a stochastické účinky ionizujícího záření i možné genetické změny či akutní nemoc z ozáření. V další části je popsán obor biologická dozimetrie, přes přiblížení od historických počátků až po současné trendy, význam oboru pro praxi a dále přehledné rozdělení biodozimetrických metod. Podrobněji jsou popsány cytologické a cytogenetické laboratorní metody a metoda vícebarevné průtokové cytometrie. Další částí je stanovení cílů diplomové práce a následně podrobněji popsána hypotéza, jež je v práci použita. V experimentální části je představen zvířecí model, jenž byl pro tuto práci použit a byl tak klíčovým bodem pro celou práci. Dále následuje metodický popis, jak probíhala izolace lymfocytů z periferní krve experimentálního zvířecího modelu, práce s buňkami a přípravy buněčných suspenzí pro jednotlivé experimentální přístupy. Podrobně je zde vysvětlen postup kultivace a ozařování analyzovaných vzorků gama zářením. Detailně se metodika věnuje mikrojadernému testu, kde je uveden nejen jeho přesný postup provedení, ale i všechna důležitá kritéria při mikroskopickém vyhodnocení mikrojader. Obdobně je popsáno stanovení jaderného proteinu H2AX pomocí vícebarevné průtokové cytometrie, kde důležitou roli hraje zejména správná fixace připravovaných vzorků. U obou metod jsou uvedeny všechny používané chemikálie, přístroje a způsob, jak byly vzorky vyhodnoceny, včetně statistické analýzy. Ve výsledkové části práce byly vytvořeny přehledné grafy s výsledky, jenž byly na závěr vyhodnoceny a v diskuzi porovnány s experimentálními přístupy a výsledky autorů zabývajících se stejnou problematikou. Nejdůležitější části práce je závěr, kde je provedeno konečné srovnání obou metod a jejich přínos pro současný obor radiobiologie.This work deals with comparison of two bio-dosimetric methods used to assess received dose of ionizing radiation. The aim of the study is to compare the results obtained using a standard cytogenetic assay and a new experimental approach that allows effective quantification of DNA breaks in nuclei of peripheral lymphocytes represented by gamma H2AX protein. The theoretical part describes the biological effects of ionizing radiation, types of radiation with their subsequent subdivisions and their properties. Further, the thesis describes dose and effect relationship, deterministic and stochastic effects of ionizing radiation as well as possible genetic changes or acute radiation illness. In the next part, the field of biological dosimetry is described, including its historical beginnings to the current trends, the importance of the field in practice and the overview of biodosimetric methods. Cytological and cytogenetic laboratory methods and method of multicolored flow cytometry are described in more detail. In the next part, the goals of diploma thesis are determined and subsequently, more detailed description of hypothesis used in the thesis is offered. In the experimental part, the animal model is presented. The model was a key source of cells for further in vitro experiments. Then, the methodical description of lymphocyte isolation from peripheral blood of experimental animal model, processing of cells and preparation of cell suspensions for individual experimental approaches follow. A detailed description of cultivation procedure and irradiation of analyzed samples by gamma radiation is provided. In detail, the methodology is dedicated to the micronucleus test. We explained its precise methodology and all important criteria for microscopic evaluation of micronuclei. Similarly, the determination of nuclear protein H2AX by multicolored flow cytometry is described, in which the correct fixation of prepared samples plays an important role. Both methods include all the chemicals used, the instruments and the way the samples were evaluated, including statistical analysis. In the result section of the thesis, graphs were created, and were evaluated and discussed in the discussion with experimental approaches and results of authors dealing with the same research topic. The most important part of the thesis is the conclusion, in which of both methods were compared and their contribution to the current field of radiobiology was assessed