Elektrische Felder an biomimetischen Grenzflächen : spektro-elektrochemische Untersuchungen des Schwingungs-Stark-Effekts an künstlichen Membranen

Abstract

Electric fields and electrostatic interactions can essentially influence biological processes. This is particularly true for membrane proteins since their activities may be controlled by changes of the transmembrane potential. To elucidate such processes requires appropriate biomimetic membranes, preferentially on electrodes to allow variations of the potential across a bilayer. Particular convenient model membranes are tethered bilayer lipid membranes (tBLM) on nanostructured Au electrodes, which were characterized with a combination of spectroscopy and electrochemistry. The Au film serves as IR signal amplifier and working electrode at the same time. Thereby, structural and functional characterizations of membrane-embedded proteins could be detected. Quantification of electric fields within the artificial biomimetic membrane is experimentally extremely challenging but of high relevance understanding molecular processes at membranes. As a particularly promising experimental approach, the vibrational Stark effect (VSE) may be exploited. The VSE refers to the electric field dependent modulation of the frequency of a localised vibrational mode. Suitable Stark reporter groups for biological systems are the thiocyanate or cyanide group, which exhibit frequencies that can easily be distinguished from lipid and protein vibrations. On the basis of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and surface-enhanced IR absorbance (SEIRA) spectroscopy the electrostatics of a frequently used simple membrane model, a self-assembled monolayer (SAM), on Au and Ag electrodes were analysed. Here we have investigated SAMs of 6-mercaptohexanenitrile (C5CN), 7-mercaptoheptanenitrile (C6CN) and 4 mercaptobenzonitrile (MBN). The potential-dependent changes of the VSE were determined on the basis of an electrostatic model to derive a relationship between the electrode potential and the electric field at the head groups of the SAMs. The analyses afforded electric field strengths in the order of 108 V/m. In this work, for the first time, Stark reporter groups were incorporated into the tBLM system on a nanostructured Au electrode. A thiocyanate labelled sterol derivate 7–beta-thiocyanocholest-5-en-3-betaylacetate (CLSCN) combined with phospholipids, 1-palmitoyl-2- oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phospho-(1’-rac-glycerol) (POPG), was used to characterise the electrostatics and local electric field inside the tBLM. To determine the relationship between the electrode potential and the transmembrane potential, i.e. the quantity controlling membrane processes, two Stark reporter groups were incorporated into the model membrane: the cyanide function of MBN as one fraction of the phase-separated SAM and the azide group introduced in the head group of a phospholipid (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(6-azidohexanoyl) - PE-N3). The combined spectroscopic and electro-chemical analysis provided insights into the electrostatics of the water reservoir between the SAM and the lipid bilayer. Upon adaptation of the electrostatic model to the tBLM system, an approximate relationship between the electrode potential and the transmembrane potential was obtained that provides a satisfactory description in the range of the effective potential of zero charge. Altogether, the present work has demonstrated the great potential of EIS and SEIRA spectroscopy in combination with the vibrational Stark effect to study electrostatic interactions and quantify local electric fields within artificial membrane models.Elektrische Felder und elektrostatische Wechselwirkungen können verschiedene biologische Prozesse wesentlich beeinflussen. So kann durch Änderungen des Transmembranpotentials die Aktivität und Struktur von Membranproteinen gesteuert werden. Zur Untersuchung dieser Prozesse sind geeignete biomimetische Modellmembranen erforderlich, die zum Zweck der Potentialkontrolle auf Elektroden aufgebracht werden. Besonders geeignete Membranmodelle sind sog. „tethered bilayer lipid membranes“ (tBLM) auf nanostrukturierten Au-Elektroden, die elektrochemisch und spektroskopisch charakterisiert wurden. Dabei dient die Au-Unterlage zum einen als IR-Signalverstärker und zum anderen als Arbeitselektrode. Mit dieser Methode wurden strukturelle und funktionelle Charakterisierungen von Membranproteinen erhalten. Die Quantifizierung elektrischer Felder oder elektrostatischer Wechselwirkungen innerhalb der künstlichen biomimetischen Membranen ist experimentell herausfordernd, aber von größter Bedeutung für das Verständnis molekularer Prozesse in Membranen. Der Schwingungs-Stark-Effekt (vibrational Stark-effect - VSE) ist dabei ein besonders vielversprechender experimenteller Ansatz, der die Modulation der Frequenz von Valenzschwingungen durch lokale elektrische Felder beschreibt. Geeignete Stark-Reportergruppen für biologische Systeme sind die Thiocyanat- oder Cyanidgruppe, deren Schwingungsfrequenzen sich leicht von Lipid- und Proteinschwingungen unterscheiden lassen. Auf der Basis der elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS) und oberflächenverstärkten IR Absorptionsspektroskopie (SEIRAS) wurden zunächst die elektrostatischen Eigenschaften der einfachsten Membranmodelle, d.h. selbstorganisierter Monolagen (SAM) auf nanostrukturierten Au- und Ag-Elektroden analysiert. Dazu wurden SAMs aus 6-Mercaptohexannitril (C5CN), 7-Mercaptoheptannitril (C6CN) und 4 Mercaptobenzonitril (MBN) untersucht. Die potentialabhängige Variation des VSE wurde auf der Grundlage eines elektrostatischen Modells beschrieben. Dabei wurden für SAM-beschichtete Elektroden lokale elektrische Felder im Kopfgruppenbereich des SAMs von 108 V/m bestimmt. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal Stark-Reportergruppen in das tBLM-System auf einer nanostrukturierten Au-Elektrode eingebaut. Dazu wurde ein Sterolderivat mit einer Thiocyanatgruppe (7-beta-Thiocyanocholest-5-en-3-betaylacetat - CLSCN) in Kombination mit Phospholipiden, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phospho-(1'-rac-glycerol) (POPG) verwendet, um die Elektrostatik und das lokale elektrische Feld in der tBLM zu charakterisieren. Zur Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Elektroden- und Transmembranpotential, d.h. der Größe, die Membranprozesse kontrolliert, wurden zwei VSE Reportergruppen in die Modellmembran eingebaut: die Cyanid-Funktion des MBN, das als eine Fraktion des Phasen-separierten SAMs diente, und die Azid-Funktion, die in die Kopfgruppe eines Phospholipids (1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(6-Azidohexanoyl) - PE-N3) inkorporiert wurde. Der kombinierte Einsatz der EIS und SEIRA Technik lieferte neue Einsichten in die elektrostatischen Eigenschaften des Wasserreservoirs zwischen SAM und Lipiddoppelschicht. Nach Anpassung des elektrostatischen Modells an die tBLM konnte eine Beziehung zwischen dem Elektroden- und Transmembranpotential entwickelt werden, das zufriedenstellende Ergebnisse im Bereich des effektiven Potentials der Nullladung lieferte. Insgesamt demonstriert die vorliegende Arbeit das große Potenzial der EIS- und SEIRA-Spektroskopie in Kombination mit dem Schwingungs-Stark-Effekts für die Quantifizierung elektrostatischer Wechselwirkungen und lokaler elektrische Felder in Membranmodellen