Aufklärung orthopockenviraler Adaptionsmechanismen mittels Proteomik und Genomik

Abstract

Adaptive changes of viruses enable the virus-host coevolution and infection of new host species. While viruses with an RNA genome adapt primarily by genomic variabilities, adaptation mechanisms of viruses with a DNA genome have remained largely elusive. Since genomes of DNA viruses are more stable compared to genomes of RNA viruses, it is assumed that mechanisms other than genomic changes underlie the adaptation of DNA viruses. However, these mechanisms have hardly been investigated so far. Since isolated virus particles are capable of crossing the species barrier, it is assumed that adaptive changes can be identified in the virus particles themselves. Therefore, this study aimed to elucidate adaptation mechanisms of DNA virus particles by proteomics and genomics technologies. While next-generation sequencing technologies are frequently used to analyze genomic changes of viruses, adaptive changes of virus particles by mass spectrometry-based proteomics have not been analyzed yet. In the present study, cowpox virus (CPXV) was used as a model virus and cell culture as a model system to study adaptive changes of DNA virus particles. CPXV is a member of the genus Orthopoxvirus (OPV) and is able infect a remarkably broad range of host species, e.g. rats, cats, elephants and humans. Increasing numbers of CPXV infections in Europe underline the need for a comprehensive understanding of OPV adaptation mechanisms. CPXV particles were isolated from a rat, which is a natural host of these viruses, and serially passaged five times in a rat and a human cell line. During passaging, an increase in viral fitness was observed exclusively in human cells, suggesting an adaptation of virus particles. Strikingly, proteome analysis revealed that the composition of virus particles changed in a cell line-specific manner, while the viral genome remained overall stable during passaging in both cell lines. Because several ubiquitination sites in virus proteins were identified, the role of ubiquitin for CPXV infection was analyzed. It was shown by the first global ubiquitination site analysis of virus particles that ubiquitin is a major conserved CPXV modification. Additionally, the dependence of CPXV replication on this protein modification was verified, making ubiquitination changes an attractive hypothesis of OPV adaptation. Furthermore, it was shown that CPXV particles incorporate intact transcripts, which presumably enable the rapid expression of viral immunomodulatory proteins upon infection. Summarized, the results of the present study lead to new findings about OPV adaptation mechanisms in vitro. These mechanisms may also apply to in vivo adaptation of DNA viruses and may enable, for example, a crossing of the species barrier. The methods established in this study enable the further characterization of OPV adaptation and, moreover, can be applied to elucidate adaptation mechanisms of viruses belonging to other families.Adaptive Veränderungen von Viren ermöglichen eine Virus-Wirt Koevolution und die Infektion neuer Spezies. Während der Adaption von Viren mit RNA Genom primär eine genomische Variabilität zugrunde liegt, sind Adaptationsmechanismen von Viren mit DNA Genom bislang nur wenig erforscht. Da das Genom von DNA-Viren stabiler ist als das von RNA-Viren, wird vermutet, dass der Adaptation von DNA-Viren andere Mechanismen zugrunde liegen als rein genomische Veränderungen. Weiterhin ist anzunehmen, dass adaptive Veränderungen im Viruspartikel selbst zu identifizieren sind, da isolierte Viruspartikel in der Lage sind die Speziesbarriere zu überwinden. Das Ziel der hier vorliegenden Studie war es daher Adaptationsmechanismen von DNA-Viren mittels Proteomik und Genomik aufzuklären. Während genomische Veränderungen von Viren häufig mittels Next Generation Sequencing analysiert werden, wurden proteomische Veränderungen viraler Partikel bislang noch nicht mit Massenspektrometrie-basierten Methoden analysiert. Als Modell-DNA-Virus für die hier vorliegende Studie wurde das Kuhpockenvirus (CPXV) gewählt und Zellkultur als System um adaptive Veränderungen zu untersuchen. CPXV gehören zum Genus der Orthopockenviren (OPV) und können eine Vielzahl von Spezies infizieren, z.B. Ratten, Katzen, Elefanten und Menschen. Die Anzahl an CPXV-Infektionen in Europa nimmt stetig zu, weshalb es notwendig ist Adaptionsmechanismen von OPV aufzudecken. CPXV Partikel wurden aus einer Ratte isoliert und für fünf Passagen in einer humanen und in einer Ratten Zelllinie vermehrt. Dabei konnte ausschließlich in humanen Zellen eine Steigerung der viralen Fitness beobachtet werden, was auf eine Adaptation der Viren hindeutet. Die Proteomanalyse zeigte, dass sich die Viruspartikel während des Passagierens Zelllinien-spezifisch veränderten, während das virale Genom jedoch insgesamt stabil blieb. Da mehrere Ubiquitinierungsstellen in viralen Proteinen detektiert wurden, wurde die Rolle von Ubiquitin für die CPXV Infektion untersucht. Mittels der ersten globalen Ubiquitinomanalyse von Viruspartikeln konnte gezeigt werden, dass Ubiquitin eine konservierte Modifikation in CPXV Proteinen ist, dessen biologische Relevanz in weiteren Experimenten bestätigt werden konnte. Veränderungen der Ubiquitinierung stellen somit eine attraktive Hypothese zur Adaptation von OPV dar. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass CPXV Partikel Transkripte inkorporieren, die vermutlich eine schnelle Expression viraler Immunmodulatoren ermöglichen. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie führen zu neuen Erkenntnissen über die Adaptationsmechanismen von OPV in vitro, die möglicherweise auch für die Adaption von DNA-Viren in vivo gelten. Die im Rahmen dieser Arbeit etablierten Methoden können weiterhin dazu genutzt werden, um die Adaptation von OPV näher zu charakterisieren und um die Adaptation von Viren anderer Familien zu untersuchen