Búsqueda de factores involucrados en el origen y la evolución de tumores mamarios murinos, su relevancia enla biología de la mama normal : participación del LIF en estos procesos

Abstract

El virus del tumor mamario murino (MMTV),es un retrovirus de tipo B que induce el desarrollo de tumores de mama, en ratones suceptibles a la infección, mediante mutagénesis insercional en genes de células somáticas. En este trabajo se utilizaron ratones de la cepa BALB/c infectados con la variante viral MMTV(LA),la cual fue encontrada previamente en nuestro laboratorio. Se ha descripto anteriormente que los ratones infectados con esta variante viral, poseen una incidencia de tumores de mama del 90%. Estos tumores presentan inicialmente un crecimiento preñez-dependiente (HD)que luego se independiza del control hormonal para mostrar un fenotipo hormono-independiente (HI). Para determinar si el compartimiento lobulo-alveolar es o no un factor relevante en la inducción de tumores por el MMTV(LA),se infectaron crías transgénicas WAP-TGFβ1 con esta variante viral mediante el amamantamiento utilizando madres infectadas con el virus. Estos ratones transgénicos expresan TGFBl bajo el control del promotor de la proteína WAP. Este promotor pertenece a una proteína de la leche abundante en murinos, es específica del epitelio mamario y se activa principalmente durante la preñez tardía y la lactancia. Ha sido demostrado previamente, que las hembras transgénicas para WAP-TGFβ1 son incapaces de amamantar a sus crías. Esto se debe a que la sobre-expresión de este factor durante la preñez, desencadena un incremento de la apoptosis en las células alveolares responsables de la producción y secreción de leche. Otra consecuencia de la expresión del transgen es la senescencia prematura de las células progenitoras (stem cells) mamarias, puesta en evidencia por la pérdida de la capacidad clonogénica de las mismas. Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que la actividad pro-apoptótica del TGFβ1 sobre las células lobulo-alveolares mamarias, no redujo la capacidad tumorigénica del MMTV(LA). Por otro lado, encontramos que la infección de las hembras WAPTGFβ1 con el MMTV(LA)revirtió la senescencia prematura de las células progenitores inducida por el transgen. El hecho que la infección con MMTV induzca el restablecimiento de la capacidad clonogénica de las “stem cells” mamarias transgénicas, sugiere que un evento temprano de la oncogénesis inducida por este vian podría ser la inmortalizaciónde las células progenitoras mamarias. Estos resultados (junto con los reportados por otros autores) sugieren que las "stem cells" mamarias podrían ser un blanco preferencial para la actividad oncogénica del MMTV. Esto implicaría un origen y crecimiento clonal para estos tumores. En relación con esta hipótesis se estudió, por análisis de Southern blot, el DNA de las inserciones virales exógenas en los pasajes de tumores mamarios inducidos por MMTV(LA). Estos experimentos se basan en el hecho que sólo puede encontrarse un patrón de bandas especifico y estable del DNA viral en todos los pasajes tumorales, si los tumores originales poseen un origen clonal u oligoclonal. El análisis de los resultados de 17 líneas tumorales in vivo generadas por pasajes singenéicos, muestran que los tumores HD se originan frecuentemente a partir de distintas células mamarias infectadas, mientras que los tumores HI surgen a partir de una sola célula. En todos los casos analizados, se encontraron nuevas inserciones de MMTV(LA) durante la progresión de tumores policlonales HD a tumores monoclonales HI. Por lo tanto, en este modelo, la progresión tumoral se produce asociada al surgimiento de clones que contienen inserciones ausentes o minoritarias en los tumores HD originales. Se ha reportado que la expresión del LIF tanto en el útero como en algunas líneas celulares de cáncer de mama puede ser regulada por estrógeno y progesterona. Sin embargo, no existían evidencias en la literatura sobre la expresión ni la actividad del LIF en la glándula mamaria normal. Por otro lado, se conoce bien que la presencia del LIF es necesaria para mantener a las “stem cells" embrionarias en estado pluripotente. Dado que la glándula mamaria está regulada por hormonas ováricas y que existen células progenitoras mamarias especificas involucradas en el desarrollo mamario normal y tumoral, nos propusimos investigar la participación del LIF en la biologia de la glándula mamaria. Nuestros resultados muestran que este factor se expresa durante el desarrollo de la glándula mamaria del ratón en mamas de hembras vírgenes y preñadas. Sin embargo, hallamos que su expresión máxima se induce durante la fase temprana de la involución mamaria postlactancia. En esta etapa, se habia demostrado que la acumulación de la leche causada por la falta de succión induce la liberación de factores locales que desencadenan la activación del factor de transcripción Stat3 y apoptosis del epitelio mamario. Aunque se sabía que dicho factor cumple un rol fundamental en desencadenar apoptosis durante esta fase, se desconocian los factores involucrados en su activación. Los resultados mostrados aquí indican que el LIF se libera como un factor local durante la fase temprana de la involución debido a la acumulación de la leche en la mama e induce apoptosis en el epitelio. Además detenninamos que el LIF es capaz de inducir la activación de Stat3 en el epitelio mamario in vivo. Por otro lado, nuestros resultados muestran que todos los tumores mamarios inducidos por MMTV(LA) poseen altos niveles de expresión de LIF y de activación de Stat3 y sugieren que el primero sería al menos parcialmente responsable de la activación del segundo. Si bien hemos encontrado el rol biológico de este camino de señalización (LIF-Stat3) en la glándula mamaria normal, queda todavía por dilucidar la significancia de este mecanismo en los tumores mamarios. En conclusión, los resultados presentados aquí refuerzan la idea que las células pluripotenciales y los factores asociados a prevenir su diferenciación, pueden cumplir un rol relevante en la biología de la glándula mamaria normal y tumoral.Mouse mammary tumor virus (MMTV) is a type B retrovirus that causes mammary tumors in susceptible mice by insertional mutagenesis. In the present work it has been used the MMTV(LA),which has been first found in our laboratory. It has been previously showed that mice infected with this variant have a mammary tumor incidence of 90%. These tumors initiain show a hormone-dependent (HD) behavior, but evolve afterwards to a hormone-independent (HI)phenotype. In order to determine whether or not the mammary gland lobulo-alveolar compartiment is relevant for MMTV(LA)-induced tumorigenesis, WAP-TGFβ1 transgenic mice were nursed with MMTV(LA) infected mothers. This transgenic mice, express TGFβ1 under the control of the whey acidic protein (WAP) promoter. This promoter corresponds to a compicuos murine milkprotein, is mammary epithelium-specific and most active during late pregnancy and lactation. It has been demonstrated that TGFβ1 transgenic female mice are unable to lactate. This is because the ectopic expression of this factor in the lobular compartment of the mammary gland during pregnancy induces an increased rate of alveolar apoptosis. Another consequence of the WAP-TGFβ1 transgene expression is the premature senescence of the mammary specific epithelial stem cells manifested in a significant decreased capacity of WAP-TGFβ1 mammary transplant to grow and repopulate a cleared normal fat pad. The results showed herein indicate that WAP-TGFβ1 expression and the consequent lower number of lobulo-alveolar cells in the transgenic animals did not abrogate MMTV(LA) capacity to induce mammary tumors. On the other hand, we have found that MMTV(LA) infection reverted the proviously observed early senecence of WAP-TGFβ1 transgenic mammary epithelium. Since MMTV infection induces a recovery in the clonogenic capacity of the transgenic mammary stem cells, it raises the possibility that mammary stem cells inmortalization would be an early event in MMTV(LA)induced tumorigenesis. Our results show that mammary stem cells could be a preferencial target for MMTV-induced tumorigenesis. This implies a clonal origin for these tumors. Then, to test this hypothesis, Southern blot analysis of MMTV insertions in tumor cell DNA was performed. These studies were carried out based on the fact that a specific and reproducible pattem of bands can only be found in a mono or oligoclonal cell populations. Analysis from 17 tumor lines generated from pregnant MMTV(LA) infected females indicated that HD tumors frequently arise from different mammary infected cells while all HI tumor variants arise from a single cell. In all the cases analyzed herein, new MMTV(LA) insertions were found during progression from policlonal HD to monoclonal HI tumors. It has been reported that leukemia inhibitory factor (LIF) expression could be regulated by estrogen and progesterone in uterus and in some mammary tumor cell lines. However, there were no reports about LIF expression or activity in the normal mammary gland. On the other hand, it is very well known the importance of the LIF presence in order to maintain pluripotent embryonic stem cells. Since mammary gland is regulated by ovaric hormone and there are mammary specific stem cells involved in normal and neoplastic development. We decided to investigate LIF participation in the mammary gland biology. Our results show that LIF is expressed during mammary development in Virgin and pregnant females. However, LIF expression picks shortly after weaning during the early phase of mammary involution. It has been demonstrated that during this period, milk stasis caused by the lack of suckling results in the induction of local factors that lead to the activation of Stat3 transcription factor and mammary epithelium apoptosis. The results presented herein demonstrate that LIF is secreted as a mammary local factor in response to milk stasis and induces mammary ephitelium apoptosis. Moreover, we also demonstrate that LIF induces Stat3 phosphorylation in the mammary gland in vivo. On the other hand, we have found high LIF expression and Stat3 activation in all the MMW(LA) induced HD and HI mammary tumors and our results suggest that LIF would be at least partialliy responsible of that activation. While the biological role of this pathway in the nomal mammary gland has been very reciently uncover, its significance in mammary neoplastic glands remains to be elucidated. In conclusion, the results showed herein support the relevant role of mammary stem cells and factors possibly associated with the prevention of their differentiation, in the biology of normal and neoplastic mammary gland.Fil:Schere Levy, Carolina P.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina