Purification, characterization, cloning and expression of malate dehydrogenases from the parasitic helminth Echinococcus granulosus

Abstract

Las isoformas de malato dehidrogenasa presentes en protoescólices de E. granalosus fueron purificadas a homogeneidad, mediante un protocolo que incluye un fraccionamiento con sulfato de amonio y la separación de las isoformas citosólica y mitocondrial mediante cromatografía de afinidad en 5'-AMP-Sefarosa. La mMDH es llevada a homogeneidad mediante la adición de una cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. La cMDH en cambio es purificada siguiendo un protocolo ya descripto que incluye cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa, filtración molecular en columna de Superosa 12 y cromatografía de afinidad en Blue Sepharose. la identidad de las isoformas fue confirmada mediante i) el estudio del comportamiento cinético de ambas en presencia de exceso del sustrato oxaloacetato, ii) el comportamiento diferencial que muestran las dos isoformas frente al detergente catiónico CTAB y iii) la secuenciación de péptidos a partir de ambas. En el caso de la mMDH, cuyo gen no se encontraba clonado, la información peptídica obtenida permitió comenzar el clonado del mismo, por amplificación de dos fragmentos del ADNc codificante de la enzima. Con ellos, se rastreó una biblioteca de ADNc de protoescólices que permitió extender la secuencia del ADNc hacia el extremo 3'. Finalmente, la secuencia del ADNc se completó utilizando la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (5' RACE), que permitió amplificar y secuencia: el extremo 5’ faltante. El ADNc completo fue utilizado para expresar, en forma recombinante, a la mMDH, en forma de fusión con la glutation-S-transferasa de S. japonicum. La proteína recombinante resultó activa y los parámetros cinéticos de la misma fueron comparados con los obtenidos para la enzima obtenida de la fuente natural. La cMDH recombinante, clonada y expresada por el grupo del Dr. Arnaldo Zaha también fue comparada cinéticamente con la enzima natural purificada en esta Tesis.The isoforms of malate dehydrogenase present in protoscolices of E. granulosus were purified to homogeneity using a protocol that includes an ammonium sulfate precipitation step and an afinity chromatogmphy step on 5’-AMP Sepharose to separate cMDH from mMDH. The mMDH is obtained in apparently homogeneous form by an additional affinity chromatography step on Blue Sepharose. The cMDH is purified following a previously described protocol that includes ion exchange chromatography on DEAE-cellulose, gel filtration on Superose 12 columns and affinity chromatography on Blue Sepharose. The identity of the purified isoforms was confirmed based on i) the kinetic behaviour of the enzymes in the presence of an excess of oxaloacetate, ii) the differential behaviour shown in the presence of the cationic detergent CTAB, and iii) by sequencing of internal peptides from both isoforms. Peptide information from mMDH was used to start the cloning of its gene. This information allowed us to amplify two fragments from the cDNA that were then used to screen a protoscolex cDNA library and obtain a positive phage which contained sequence information corresponding to the 3’ end of the cDNA. The remaining 5' end was amplified using the 5' RACE technique. The full-length CDNA was then used to produce recombinant mMDH as a fusion protein with the S. japonicum glutathione-S-transferase. The recombinant protein was active and its kinetic parameters were compared with those of the natural enzyme. The recombinant cMDH, cloned and expressed by Dr. Zaha’s group was also compared kinetically with the natural enzyme purified in this Thesis.Fil:Agüero, Fernán Gonzalo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina