Desarrollo y aplicación de un sistema de expresión de poliproteínas autoclivables basado en la proteasa NIa del virus TEV para la obtención de plantas transgénicas con capacidad de procesar, secretar y dirigir subcelularmente las proteínas expresadas

Abstract

Se desarrolló, perfeccionó y evaluó la factibilidad de aplicación práctica de un vector detransformación genética vegetal que permite la coexpresión de varias proteínas bajo elcontrol de un promotor común. El sistema desarrollado basado en la proteasa NIa derivada del TEV fue capaz deprocesar poliproteínas quiméricas y producir la acumulación de varias proteínas a partirde una única unidad transcripcional in vivo. Se expresaron diferentes combinaciones deproteínas (indicadoras, como GFP y GUS, cápsides de PVX, PVY y PLRV, así comoproteínas de defensa antifúngica) in vivo e in vitro. El nivel de acumulación de cadaproteína no dependió de la posición del ORF en la poliproteína. A pesar de lo expuestoel nivel de acumulación total de una proteína expresada a través de la poliproteína puedeser influenciada por propiedades intrínsecas de las mismas. Mediante microscopíaelectrónica se demostró que la cápside de PVY expresada a través de la poliproteína nosólo se procesa correctamente sino que el producto del procesamiento es capaz deformar partículas parecidas a virus (cápsides vacías). Cuando se agregó la señal de exportación al RE del gen de la patatina apoliproteínas conteniendo GUS y GFP, éstas fueron dirigidas al RE en protoplastos detabaco de la línea BY-2. Las plantas transgénicas de papa expresando estas poliproteínasmostraron menor actividad GUS que las plantas control expresando la mismapoliproteína pero sin señal de exportación. Este menor nivel de actividad podría seratribuido a que la proteína GUS resulta glicosilada en el RE. Estos resultados sugierenque la poliproteína es dirigida al RE y luego en el lumen procesada para liberar lasproteínas individuales. Se obtuvieron plantas de papa transgénica expresando poliproteínas conteniendocuatro genes antifúngicos, codificantes para una quitinasa, una glucanasa, AP24 y RIP. Se obtuvieron plantas altamente resistentes a el ataque de R. solani, demostrando elcorrecto procesamiento de la poliproteína y el sinergismo de las proteínas antifúngicasexpresadas para producir resistencia. Se encontró una asociación entre el espaciosubcelular de acumulación de las proteínas glucanasa y AP24 (vacuolar versusapoplásmico) con el nivel de resistencia contra Rhizoctonia.Development, characterization, as well as practical application of a plant transformationvector allowing the coexpression of different proteins under the control of a singlepromoter, is described. The system, based on NIa protease gene derived from tobaccoetch potyvirus was shown to express and process chimerical polyproteins and toaccumulate different proteins from a single transcription unit, including reporter genes (green fluorescent protein —GFP-and β-glucurunidase —GUS-), as well as coat proteinsof potato virus Y (PVY), potato virus X (PVX) and antifungal proteins. Thus, differentcombinations of proteins were expressed in vitro or in vivo showing that proteinaccumulation does not depend upon relative position of the ORF within the cassette. However, the overall level of accumulation may be influenced by intrinsic properties ofthe expressed proteins. Electron microscopy showed that the PVY CP expressed in thepolyprotein cassette assembled in vivo to form void virus-like-particles. Addition of the endoplasmic reticulum (ER) targeting sequence from patatin tothe polyprotein containing GUS and GFP, targeted the protein to ER, in BY-2 tobaccoprotoplasts. Transgenic plants that encode the thus polyprotein exhibited lowerenzymatic activity than transgenic plants expressing GUS from the cassette without thepatatin leader sequence. Indirect evidence suggests that the low level of activity is theresult of glycosylation of GUS in the ER. These results suggest that the polyprotein isfirst targeted to the ER where the polyprotein is processed to release the individualproteins. Transgenic potato plants expressing a polyprotein including four anti-fungal ORFs (chitinase, glucanase, AP24 and a RIP) were produced. High levels of protectionagainst Rhizoctonia solani attack were shown, confirming the correct processing andsynergism of these proteins to produce resistance. We found an association between thesubcellular localization of the introduced glucanase and the level of resistance. Protein AP24 showed a similar but less apparent behavior. We conclude that the vector system pPRO10/20 is highly effective to expressseveral proteins in planta. The expressed proteins can be, cytoplasmic or exported to theapoplasm or other subcellular compartments like vacuoles.Fil: Asurmendi, Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina