Ensayos pre-clínicos de dos vacunas inmunoterapéuticas con actividad antitumoral desarrolladas a partir de gangliósidos

Abstract

Para el año 1934 la toxina de Coley era el único tratamiento sistémico para el tratamiento de cáncer. Este preparado fue desarrollado unos años antes por el prestigioso cirujano del Memorial Hospital de New York, William B. Coley, utilizando toxinas bacterianas de los géneros Serratia y Streptococcus. Este producto se convirtió así en la primera vacuna oncológica y en uno de los primeros tratamientos sistémicos del cáncer. A pesar de los experimentos iniciales del siglo pasado, luego de los ensayos de Coley la inmunoterapia oncológica fue dejada de lado por el advenimiento de las drogas quimioterapéuticas y las mejoras en la radioterapia. En las últimas décadas se ha vuelto a observar a la inmunoterapia como una estrategia complementaria válida para el tratamiento de cáncer. Este nuevo interés sobre este tipo de tratamientos, tiene sus bases en el gran avance alcanzado en el entendimiento de los mecanismos inmunológicos y de los procesos que dominan la biología tumoral. En esta tesis se presentan resultados relativos a dos vacunas desarrolladas a partir de gangliósidos, moléculas de membrana anfipáticas que pertenecen a la familia de los glicoesfingolípidos con por lo menos, un residuo de ácido siálico lo cual es una característica distintiva de estos compuestos. Los resultados se centran en la evaluación de los efectos tóxicos, la respuesta antitumoral y la modulación inmunológica desencadenados por la aplicación de vacunas inmunoterapéuticas a base de gangliósidos, consistentes en un anticuerpo anti-idiotipo dirigido a gangliósidos glicolilados (anticuerpo 1E1O) y de una vacuna molecular del gangliósido NacGM3 conjugado a proteínas externas de membrana de N. Meningitidis proteoliposomas de muy pequeño tamaño (NacGM3/VSSP). Con este fin se evaluará también el perfil de los modelos murinos experimentales de cáncer mamario y melanoma a emplearse para cada vacuna, respectivamente. Los resultados demuestran que los modelos animales elegidos presentan características adecuadas para ser utilizados como herramientas de evaluación de los efectos y mecanismos desencadenados por la inmunización con las vacunas. La línea celular de cancer mamario murino F3II crece en el espacio subcutáneo desarrollando un fenotipo tumoral altamente maligno. Su portación produce un cuadro inmunoestimulatorio posiblemente ligado a la secreción de GM-CSF, citoquina ante la cual se modifica su respuesta proliferativa. Además estas células son reactivas al anticuerpo P3, precursor del 1E10, lo que la convierte en un modelo apropiado para la evaluación de la respuesta antitumoral de 1E10. La inmunización de ratones con el preparado 1E10-KLH no produce efectos tóxicos de magnitud en los animales, desarrollando una respuesta tumoral que es capaz de reconocer a las células F3II. Utilizando este proceso de inmunización se puede observar un retardo en el crecimiento tumoral y una disminución significativa en el recuento de metástasis espontáneas en los ratones tratados. Además se evaluó a la línea B16 crecida en animales singénicos como modelo de estudio de los efectos producidos por la vacunación con NacGM3/VSSP. Las células B16 presentan en su membrana al gangliósido NacGM3, reaccionando positivamente ante la presencia del mismo en el medio de cultivo. La vacunación de ratones C57 con NacGM3/VSSP desarrolla una respuesta inmunológica humoral que es capaz de reconocer a los componentes de la vacuna y a las células de melanoma B16. La aplicación de la vacuna no produce efectos tóxicos de importancia. La vacunación con NacGM3/VSSP genera una respuesta antitumoral que se manifiesta en el rechazo del desafío tumoral en el 100% de los animales vacunados. Esta respuesta se mantiene en el tiempo hasta tres meses luego de finalizada la misma. La respuesta antitumoral obtenida es dosis dependiente ya que se pudo observar una actividad antitumoral creciente en lotes de ratones inmunizados con una concentración vacunal de hasta 360 μg/dosis y específica hacia células que expresan el gangliósido NacGM3). La vacunación con NacGM3/VSSP desarrolla una respuesta de anticuerpos con preponderancia del isotipo IgG2b. Estos anticuerpos reconocen cortes de tumor B16 siendo su epítope reactivo el residuo de ácido sialico presente en las células. La investigación básica en vacunas provee un mejor entendimiento de los mecanismos inmunológicos involucrados en el rechazo tumoral inducidos por la vacunación. Los ensayos preclínicos con modelos animales de cáncer son de importancia capital en el estudio de los efectos inmuno modulatorios de estas vacunas y en la evaluación de sus capacidades terapéuticas a nivel clínico.By 1934 Coley's toxin was the only systemic treatment for cancer. This compound was developed few years before for the famous surgeon from The Memorial Hospital of New York, William B. Coley, using bacterial toxins from Serratia and Streptococcus. This product become the first cancer vaccine and one of the first systemic treatments for cancer. Despite the initial experiments carried out in the last century, after Coley attempts cancer immunotherapy was abandoned due to the appearance of quimiotherapeutic drugs and improvements in radiotherapy. In the last decades, immunotherapy is seeing again as a valid adiuvant therapy for cancer treatment. This new interest in this kind of treatments, is based in the important advance reached in the understanding of immunology and the processes that govern tumor biology. In this thesis, results related with two vaccines based in gangliosides are presented. Gangliosides are amphipatic membrane molecules that belong to the glicoesfingolipid family, having at least one residue of sialic acid, which is a distinctive characteristic of this kind of compounds. The results focus in the evaluation of toxicity, antitumoral response and the immunological modulation due to the application of this two vaccines, one an antiidiotypic antibody against glycolilated gangliosides (1E1o antibody) and other a molecular vaccine composed by the ganglioside NacGM3 conjugated to proteins from the outer membrane of N. Meningitidis in proteoliposomes of very small size (NacGM3/VSSP). With this reasoning in mind, the profile of the experimental murine models of breast cancer and melanoma to be employed with each vaccine, was also evaluated. Results demonstrated that the animal models chosen have the characteristics needed to be used as evaluation tools of the effects and mechanisms developed by the immunization with the vaccines. F3II murine breast cancer cell line grows in the subcutis developing a highly malignant tumor phenotype. Its bearing produce an immunoestimulatory effect probably related to the secretion of GM-CSF, a cytoquine able to modify its proliferative response. Furthermore, this cells are reactive to P3 antibody, a precursor of 1E10, becoming a very adequate model for the evaluation of 1E10 antitumor response. Immunization of mice with the preparation 1E10-KLH did not produce relevant toxic effects in the animals, developing a humoral response able to recognize F3II cells. Using this immunization process it can be observed a delay in tumor growth an a significant decrease in the number of spontaneous metastasis in treated animals. Also, the B16 line, growing in singenic animals, as a study model of the effect produced by vaccination with NacGM3/VSSP, was evaluated. B16 cells have in its membrane NacGM3 ganglioside. Vaccination of C57 mice with NacGM3/VSSP developed a humoral immunologic response able to recognize both, components of the vaccine and B16 melanoma cells. Administration of the vaccine did not produce relevant toxic effects. Vaccination with NacGM3/VSSP generated an antitumoral response that translated in the rejection of the tumor challenge in 100% of the vaccinated animals. This response is sustained in the time up to three months after final inoculation. The antitumoral response obtained is dose-dependent since was observed an increasing antitumoral activity in mice immunized with a vaccine concentration of up to 360 μg/dose, being specific towards cells expressing NacGM3 ganglioside. Vaccination with NacGM3/VSSP developed an antibody response mostly based in the isotype IgG2b. This antibodies recognize B16 tumor slides being its reactive epitope the sialic acid residue which is present in the cells. Basic research in vaccines provide a better understanting of the immunologic mechanisms involved in tumor rejection induced by vaccination. Preclinical experiments with animal models of cancer are of utmost importance in the study of the immunomodulatory effects of this vaccines and the evaluation of its therapeutic capabilities at the clinical level.Fil:Gabri, Mariano Rolando. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina