La mutación JAK2V617F constituye la alteración molecular más frecuente en Neoplasias Mieloproliferativas Crónicas BCR-ABL-negativas, detectándose en > 95% de los pacientes con Policitemia Vera y alrededor de 50-60% de aquellos con Mielofibrosis Primaria y Trombocitemia Esencial. Constituye un marcador clonal, siendo su utilidad diagnóstica principal la diferenciación entre desórdenes neoplásicos y condiciones reactivas. Además de las Neoplasias Mieloproliferativas BCR-ABL-negativas, puede detectarse con menor frecuencia en otras Neoplasias Mieloides. Los pacientes con Trombocitemia Esencial portadores de esta mutación presentan un moderado incremento en el riesgo trombótico, si bien su presencia no constituye por sí misma un parámetro que determine la decisión terapéutica. Hasta el presente, si bien se ha descripto mayor riesgo de trombosis y transformación a mielofibrosis en los pacientes con niveles más elevados de carga alélica JAK2V617F, la utilidad de su medición en el manejo clínico o el monitoreo del tratamiento en los pacientes con Neoplasias Mieloproliferativas no es clara.The JAK2V617 mutation is the most frequent molecular abnormality underlying the pathogenesis of chronic myeloproliferative neoplasmas. More than 95% of patients with polycythemia vera and around half of those with essential thrombocythemia and primary myelofibrosis carry this mutation. It is useful to distinguish clonal from reactive conditions and is one of the diagnostic criteria included in the WHO classification. It may be detected, albeit with low frequency, in other myeloid neoplasms. Although a moderate increase in the thrombotic risk has been described for JAK2V617F-positive essential thrombocythemia patients, its presence does not represent by itself a parameter to guide treatment recommendations. Patients with high JAK2V617F allelic burden have increased risk of thrombosis and myelofibrotic transformation. However, the role of allele burden measurement in the clinical management and treatment monitoring of patients with myeloproliferative neoplasms remains to be determined.Fil: Heller, Paula Graciela. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Medicas; ArgentinaFil: Lev, Paola Roxana. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Medicas; Argentin

Heller, Paula Graciela

Lev, Paola Roxana

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176 HEMATOLOGÍA • Volumen 17 N° 2: 176-178, 2013Estudio molecular en Neoplasias Mieloproliferativas Crónicas:mutación JAK2V617FLev P.R., Heller P.G.Servicio de Hematología Investigación.Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari.Universidad de Buenos Aires. CONICET.paulaheller@hotmail.comFecha de recepción: 29/06/2013 Fecha de aprobación: 05/07/2013 LABORATORIO ENHEMATOLOGIAHEMATOLOGÍA, Vol.17 N°2: 176-178 136 Mayo - Agosto 2013ResumenLa mutación JAK2V617F constituye la alteración molecular más frecuente en Neoplasias Mielo-proliferativas Crónicas BCR-ABL-negativas, de-tectándose en > 95% de los pacientes con Polici-temia Vera y alrededor de 50-60% de aquellos con Mielofibrosis Primaria y Trombocitemia Esencial. Constituye un marcador clonal, siendo su utilidad diagnóstica principal la diferenciación entre desór-denes neoplásicos y condiciones reactivas. Además de las Neoplasias Mieloproliferativas BCR-ABL-negativas, puede detectarse con menor frecuencia en otras Neoplasias Mieloides. Los pacientes con Trombocitemia Esencial portadores de esta mu-tación presentan un moderado incremento en el riesgo trombótico, si bien su presencia no consti-tuye por sí misma un parámetro que determine la decisión terapéutica. Hasta el presente, si bien se ha descripto mayor riesgo de trombosis y transfor-mación a mielofibrosis en los pacientes con niveles más elevados de carga alélica JAK2V617F, la utili-dad de su medición en el manejo clínico o el moni-toreo del tratamiento en los pacientes con Neopla-sias Mieloproliferativas no es clara.Palabras clave: JAK2617F, carga alélica, neoplasias mieloproliferativas crónicasAbstractThe JAK2V617 mutation is the most frequent mo-lecular abnormality underlying the pathogenesis of chronic myeloproliferative neoplasmas. More than 95% of patients with polycythemia vera and around half of those with essential thrombocythemia and primary myelofibrosis carry this mutation. It is useful to distinguish clonal from reactive condi-tions and is one of the diagnostic criteria included in the WHO classification. It may be detected, albe-it with low frequency, in other myeloid neoplasms. Although a moderate increase in the thrombotic risk has been described for JAK2V617F-positive essential thrombocythemia patients, its presence does not represent by itself a parameter to guide treatment recommendations. Patients with high JAK2V617F allelic burden have increased risk of thrombosis and myelofibrotic transformation. However, the role of allele burden measurement in the clinical management and treatment monitor-ing of patients with myeloproliferative neoplasms remains to be determined.Key words: JAK2V617F, allele burden, myeloprolif-erative neoplasms177EsTUdIO MOLECULAR EN NEOPLAsIAs MIELOPROLIfERATIVAs CRóNICAs...HEMATOLOGÍA • Volumen 17 N° 2: 176-178, 2013IntroducciónJAK2 es una tirosina quinasa citoplasmática asocia-da a receptores de diversas citoquinas hematopoyéticas involucrada en la transducción de la señal intracelu-lar en respuesta al estímulo con estas citoquinas. En el año 2005, se identificó la presencia de la mutación JAK2V617F en pacientes con Neoplasias Mieloprolife-rativas Crónicas BCR-ABL-negativas (NMP), contri-buyendo al conocimiento de la biología molecular de estas neoplasias. Esta mutación consiste en una trans-versión G por T en el exón 14 del JAK2, resultando en un cambio de valina por fenilalanina en la posición 617 (V617F) e induce la activación constitutiva de la activi-dad quinasa del JAK2 y de las vías de transducción de la señal intracelular gatilladas por el mismo, favoreciendo la proliferación celular y la resistencia a la apoptosis. Esta mutación se encuentra en 50 a 60% de los pacien-tes con Trombocitemia Esencial (TE) y Mielofibrosis Primaria (MP) y en más del 95% de aquellos con Po-licitemia Vera (PV). Alrededor de un tercio de los pa-cientes con PV y MP son homocigotas para la misma, mientras que éste es un evento poco frecuente en TE. Además de la presencia o ausencia de JAK2V617F, la carga alélica de esta mutación, determinada por la pro-porción entre el alelo mutado respecto al total, tendría importancia en la patogenia de la enfermedad.  La mutación JAK2V617F no es específica de las NMP BCR-ABL-negativas clásicas, sino que puede ha-llarse con menor frecuencia en otras neoplasias mieloi-des, como los sindromes mixtos mielodisplásicos/mie-loproliferativos, especialmente en la anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociada a trombocitosis (hasta 50% de los casos), neoplasias mieloproliferativas no caracterizadas y, raramente, en pacientes con mie-lodisplasia o leucemia mieloide aguda, generalmente secundaria a NMP. Por otra parte, los pacientes con trombosis venosa esplácnica, ya sea trombosis portal o síndrome de Budd-Chiari, son frecuentemente porta-dores de la mutación JAK2V617F, 40% y 28%, respec-tivamente, en ocasiones en ausencia de NMP evidente. Esta situación también puede ocurrir en pacientes con trombosis venosa cerebral, en los que se detecta esta alteración molecular en el 6% de los casos. Además de la mutación JAK2V617F, se han des-cripto otras alteraciones moleculares en NMP, inclui-das las mutaciones en el exón 10 del receptor MPL (en TE y MP), el exón 12 del gen JAK2 (en PV), en los ge-nes LNK y CBL y, más recientemente, en el gen TET2 y otros reguladores epigenéticos, como ASXL1, EZH2, IDH1/2 y DNMT3a. La identificación de mutaciones en otro grupo de genes, involucrados en la maquinaria de splicing del ARN, como SRSF2 y SF3B1, ha contri-buido a poner de manifiesto la complejidad y heteroge-neidad existente en la biología molecular de las NMP, especialmente en MP.Fundamento del ensayoLa determinación de la mutación JAK2V617F se lleva a cabo utilizando una muestra de ADN genómico obtenido a partir de leucocitos totales de sangre perifé-rica anticoagulada con EDTA. Alternativamente, pue-de efectuarse en granulocitos purificados o en ARN de plaquetas. La detección también puede realizarse en cé-lulas de médula ósea, siendo la sensibilidad equivalente a la de sangre periférica. Una vez obtenido el ADN, que debe ser de adecuada calidad y pureza, la detección de la mutación JAK2V617F puede efectuarse mediante di-versas técnicas, entre las que se incluyen la PCR alelo-específica, PCR seguida de digestión enzimática y la se-cuenciación de ADN, siendo la PCR alelo-específica la más frecuentemente utilizada. El nivel de sensibilidad recomendado para la detección de rutina de esta muta-ción es de 1-3%. La sensibilidad de la PCR alelo-espe-cífica o digestión enzimática oscila alrededor de 1-5%, dependiendo de la técnica, mientras que la secuencia-ción es menos sensible, alrededor de 10-20%. PCR alelo-específicaEsta técnica se realiza con 3 primers diferentes, JAK2 reverse (R), JAK2 forward (F) y JAK2 mutado (M).  El par JAK2R-JAK2F amplifica un fragmento del gen JAK2 que incluye la secuencia en la cual se localiza la mutación  y  se utiliza como control de amplificación y calidad de la muestra. El tercer primer (JAK2M), es-pecífico para la mutación, amplifica solo en caso de que la misma esté presente, utilizando el primer JAK2F o JAK2R como extremo. Como controles de la reacción se utiliza una muestra positiva, una muestra negativa y un tubo sin ADN. El producto de la amplificación se siembra en un gel de agarosa al 2% que se tiñe con bro-muro de etidio. Según lo descrito, en un paciente con la mutación se observan dos bandas, el control de ampli-ficación, que será visto en todas las muestras, incluidas las de los pacientes normales, y una banda de menor tamaño, presente solo en los pacientes JAK2 positivos. PCR seguida de digestión enzimatica.El cambio de una guanina por una timina, que ori-gina la mutación V617F, genera un sitio  de restricción 178 HEMATOLOGÍA • Volumen 17 N° 2: 176-178, 2013LAbORATORIO EN HEMATOLOGÍAespecífico para la enzima BsaXI. Por lo tanto, se amplifi-ca por PCR la región flanqueante a la mutación con dos primers específicos, se realiza una digestión enzimática y se siembra el producto de la digestión en un gel de agarosa al 2%. En presencia de la mutación, se observan dos bandas de menor peso molecular correspondientes a los fragmentos digeridos, mientras que en ausencia de mutación se observa una sola banda de mayor peso molecular, no digerida. En los individuos heterocigotas se observa la banda no digerida correspondiente al ale-lo normal y las bandas de menor peso molecular que reflejan el alelo mutado. Por lo tanto, mediante esta téc-nica, además de determinar si un individuo es positivo o negativo para la mutación, es posible establecer si es homo u heterocigota para la misma.Cuantificación de la carga alélica JAK2V617FLa cuantificación de la carga alélica JAK2V617F se encuentra, hasta el presente, poco estandarizada. Se han desarrollado una variedad de técnicas, la mayoría de las cuales se basan en PCR en tiempo real, utilizando primers alelo-específicos y SYBR Green I o, más fre-cuentemente, la detección se realiza con sondas tipo Taqman. La cuantificación puede efectuarse en ADN obtenido de granulocitos purificados de sangre perifé-rica, leucocitos totales o células mononucleares de mé-dula ósea, siendo la primera muestra la más utilizada. Los resultados se expresan como porcentaje del alelo mutado (% JAK2V617F) respecto al JAK2 total, requi-riéndose disponer de un estándar con % JAK2V617F conocido, respecto al cual referir la determinación.Utilidad clínica La aplicación clínica principal de la detección de la mutación JAK2V617F radica a nivel del diagnóstico de las NMP. Constituye un marcador clonal, permitiendo diferenciar desórdenes neoplásicos de aquellos reac-tivos, constituyendo uno de los criterios diagnósticos para PV, TE y MP establecidos por la WHO. La presen-cia de esta mutación no permite discriminar entre los distintos NMP entre sí (TE vs. MF vs. PV), ni tampo-co entre éstos y otras neoplasias mieloides, las cuales con menor frecuencia pueden presentar esta alteración molecular, siendo necesario utilizar otros criterios diagnósticos clínicos e histológicos para su adecuada clasificación. Por otra parte, la ausencia de la mutación JAK2V617F no excluye el diagnóstico de TE o MP, ya que alrededor de la mitad de los pacientes no presen-tan esta alteración, mientras que en el caso de la PV, lo hacen poco probable, en cuyo caso la medición de los valores de EPO y la detección de mutaciones en el exón 12 podrían contribuir al diagnóstico. Excepto en trombosis venosa esplácnica o cerebral, la inclusión de rutina del JAK2V617F entre los estudios de trombofilia en pacientes con trombosis arterial o venosa en ausen-cia de NMP evidente no estaría justificada. En cuanto a la implicancia clínica, la presencia de la mutación JAK2V617F en TE se asociaría a un mo-derado aumento en el riesgo trombótico, aunque su presencia no constituye por sí misma una indicación de tratamiento citoreductor. No existen evidencias de que la presencia de la mutación modifique el riesgo de evolución a mielofibrosis o leucemia aguda en TE ni el pronóstico de esta enfermedad. Por otra parte, en MP, no se han descripto diferencias consistentes entre pa-cientes positivos y negativos para JAK2V617F. La carga alélica también tiene implicancia en las manifestacio-nes clínicas y en la evolución de la enfermedad. Niveles superiores de carga alélica en PV y TE se relacionan con mayor frecuencia de trombosis y transformación a mielofibrosis, mientras que, llamativamente, en MP, los pacientes con niveles inferiores de carga alélica (1-25%) son los que presentan peor pronóstico.  La importancia de la cuantificación de la carga alélica en el manejo clí-nico de los pacientes con NMP aún no está definida y la utilidad del monitoreo de la respuesta molecular du-rante el tratamiento con interferón-alfa o inhibidores de JAK1/2 se encuentra en evaluación.Declaración de conflictos de interesesLas autoras declaran no poseer conflictos de intereses.Bibliografía1. Bench AJ, White HE, Foroni L y col. Molecular diagnosis of the myeloproliferative neoplasms: UK guidelines for the detection of JAK2 V617F and other relevant muta-tions. Br J Haematol 2013; 160: 25-34.2. Heller PG, Lev PR, Salim JP y col. JAK2V617F mutation in platelets from essential thrombocythemia patients: correlation with clinical features and analysis of STAT5 phosphorylation status. Eur J Haematol 2006; 77: 210-6.3. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, Pardanani A, Tefferi A. Clinical correlates of JAK2V617F presence or allele burden in myeloproliferative neoplasms: a critical reappraisal. Leukemia 2008; 22: 1299-307.4. Lippert E, Girodon F, Hammond E y col. Concordance of assays designed for the quantification of JAK2V617F: a multicenter study. Haematologica 2009; 94: 38-45.

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Estudio molecular en Neoplasias Mieloproliferativas Crónicas: mutación JAK2V617F

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