Inflammation is a defense response of the body to an event of injury or tissue damage. Leukocytes circulating in the bloodstream are stimulated by chemokines released by endothelial cells that enable them to adhere and transmigrate to the site of infection. Leukocyte extravasation from the blood vessels towards the site of inflammation is a sequential and overlapping process involving leukocyte rolling, adhesion and transendothelial migration. Adhesion is critical for T-cell trafficking and antigen recognition and is mediated in part by integrins, a large family of αβ heterodimeric cell surface proteins. The β2-integrin lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1 /αLβ2) and the β1-integrin very late antigen-4 (VLA-4/α4β1) promote T cell interactions with their ligands intercellular and vascular cell adhesion molecules (ICAMs and VCAMs) respectively which are expressed on endothelial cells. VLA-4 and LFA-1 directly participate in cell arrest under flow, whereas firm adhesion is mediated by LFA-1. Integrins have unique characteristics of signaling in both directions across the membranes. Inside-out signaling occurs by ligand binding to non-integrin receptors, which can activate integrins through intracellular signal transduction whereas outside-in signaling takes place by binding of ligands to the integrin itself.
The complex signaling pathways of LFA-1 are regulated by rapid phosphorylation and dephosphorylation events of LFA-1, which affect its binding affinities and subsequently protein-protein interactions. My interest lies how the activation of LFA-1 by inside-out and outside-in signaling affects the phosphorylation of the αL- and β2-chains, the adhesive property of LFA-1, intracellular binding partners and cross-talk with the VLA-4 integrin.
In my study, I have found involvement of Tiam1, a Rac GEF (Guanine nucleotide exchange factor) protein as a new key player in the intracellular signaling of LFA-1. Upon LFA-1 activation by inside-out signaling, Tiam1 forms a complex with β2 phosphorylated on Thr-758 and the scaffolding protein 14-3-3, which activates Rac1, an actin-regulating protein. Downregulation of Tiam1 inhibits Rac1 activation and furthermore, it impairs cell adhesion to the LFA-1 ligand ICAM-1. The next finding was that the activation of LFA-1 via inside-out or outside-in signaling downregulates VLA-4 binding to its ligand VCAM-1. When LFA-1 is activated, β2 is phosphorylated on Thr-758, which recruits 14-3-3 and Tiam1 and results in crosstalk to VLA-4. It leads to dephosphorylation of Thr-788/789 on the β1-chain, which results in the recruitment of more filamin but less 14-3-3 to the β1-chain. I have also demonstrated that the activation of LFA-1 by anti-LFA-1 antibodies binding to the extracellular part is mediated through phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) activation, which causes the phosphorylation of the Thr-758 on β2-chain. Furthermore, I have shown that the phosphorylation of the LFA-1 αL-chain at Ser-1140 is essential for the functionally significant phosphorylation of the β-chain Thr-758 and protein interaction with the β2-chain. Mutation of Ser-1140 to alanine in the αL-chain significantly decreased Thr-758 phosphorylation of β2-chain after SDF-1α or anti-CD3 activation.
α-Actinin is an actin-binding protein, which links integrins to the actin cytoskeleton and is crucial for cell migration. We showed that mutation of Ser-1140 to alanine in the αL-chain affects the α-actinin interaction with the β2-chain and chemotactic directional migration. Phosphorylation and de-phosphorylation of αL- and β2- chains may be a way to regulate adhesion and deadhesion turnover of cells during migration.
De-regulation of integrins’ function may lead to auto-immune and chronic inflammatory diseases. Here in this thesis, I have now revealed some novel, important mechanisms of the regulation of the leukocyte integrins. The knowledge of how integrins are regulated could be beneficial in clinical applications as well as for developing drugs with high specificity in future.Inflammation är kroppens försvarsmekanism mot infektioner och vävnadsskador. Leukocyter som cirkulerar i blodet stimuleras av kemokiner, vilka frisätts av inflammerade endotelceller. Det gör att leukocyterna kan binda till endotelcellerna och transmigrera till infektions-stället. Leukocyt-extravasionen från blodkärlen sker stegvis: leukocyterna rullar på endotelcellerna, binder till dem och migrerar genom endotelcellbarriären ut i vävnaderna.
Adhesion behövs för att T-celler skall kunna cirkulera i kroppen och för att de skall känna igen antigener. Dessa processer regleras delvis av integriner, en stor proteinfamilj som består av αβ-heterodimerer uttryckta på cellytan. β2- integrinet LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1, αLβ2) och β1-integrinet VLA-4 (very late antigen-4, α4β1) främjar T-cell interaktioner med ligander på endotelcellytan; ICAM (intercellulär adhesions molekyl) och VCAM (vaskulär adhesionsmolekyl). Endotelcell-interaktioner via T-cellens LFA-1 och VLA-4 möjliggör celladhesion vid flöde, medan stark adhesion regleras främst av LFA-1. Integriner är unika eftersom de kan signalera i två riktningar över membranen. Signalering inifrån-ut sker då olika cellulära receptorer binder ligander, vilket kan aktivera integriner genom intracellulär signalering, medan signalering från utsidan-in sker då ligander binder direkt till integrinet.
LFA-1 kan initiera flera intracellulära signaleringssystem. LFA-1-akiverad signalering regleras av snabba fosforyleringar och defosforyleringar, vilket påverkar LFA-1-proteinets affinitet för specifika proteininteraktioner. Jag är intresserad av hur LFA-1-aktivering via inre och yttre mekanismer påverkar fosforyleringen av αL- och β2-kedjorna, proteinets förmåga att binda extracellulära ligander och intracellulära protein samt hur detta påverkar VLA-4-integrinets aktivitet.
I mina studier har jag identifierat en ny komponent i en signalkaskad aktiverad av LFA-1, Tiam1, som är ett Rac GEF protein (guanine nucleotide exchange factor). Då LFA-1 aktiveras via intracellulär signalering, byggs ett komplex upp med LFA-1 β2 fosforylerad på treonin-758, proteinet 14-3-3 och Tiam1. Detta komplex aktiverar Rac1 som reglerar aktin-cytoskelettet. Om Tiam1 nedregleras, inhiberas Rac1 aktivering och cellens förmåga att binda LFA-1-liganden ICAM. Vi visade också att LFA-1-aktivering via inre och yttre signaleringsvägar nedreglerar VLA-4 integrinets förmåga att binda liganden VCAM1. När LFA-1 aktiveras, forsforyleras treonin-758 på β2-kedjan, vilket rekryterar 14-3-3 och Tiam1 och leder till korsreglering av VLA-4 via intracellulär signalering. Detta leder till defosforylering av treoninerna 788/789 på β1, ökad VLA-4-binding till filamin men minskad binding till 14-3-3.
Jag har också visat att LFA-1 aktivering med extracellulära antikroppar mot LFA-1 sker via fosfolipas C (PLC) och proteinnkinas C (PKC), vilket leder till fosforylering av treonin-758 på β2 kedjan. Vidare har jag visat att fosforylering av αL-kedjans serin-1140 är nödvändigt för att β2-kedjans funktionellt viktiga treonin-758 skall kunna fosforyleras. Om αL-kedjans serin-1440 är muterat till alanin kan β2 kedjans treonin-758 inte fosforyleras i aktiverade celler och β2 fosforyleringen är reducerad efter anti-CD3 aktivering.
α-aktinin är ett aktin-bindande protein som länkar integriner till cellens cytoskelett och är nödvändigt för cellmigration. Vi visade att interaktionen mellan α-aktinin och β2-kedjan minskade, och riktad migration var förhindrad i celler där αL-kedjans serin-1140 var muterat till alanin. Fosforylering och defosforylering av αL- and β2-kedjorna kan vara ett sätt reglera adhesion och de-adhesion när cellen rör på sig.
Autoimmuna sjukdomar och kroniska inflammationer kan orsakas av felaktig reglering av integrinets funktioner. I denna avhandling har jag identifierat några nya, viktiga regleringsmekanismer för leukocytintegriner. Kunskapen om hur dessa sker kan vara viktig i kliniska applikationer och för att utveckla läkemedel med hög specificitet
