Development of in vitro co-culture models and characterization of biofilm inhibitors for bio-fabrication of medical devices and drug discovery applications

Abstract

Nosocomial infections imply a great risk for hospitalized patients, causing around 90 000 deaths per year just in the European Union. Bacterial biofilms- microaggregates of bacteria attached to a surface and embedded in a self-produced matrix-are often responsible of this kind of infections, especially those related to medical device use. Medical devices offer an ideal surface for bacteria to attach and form a biofilm and, by switching into this state, bacteria can withstand antibiotic chemotherapy and evade the immune system of the host. One of the current problems to tackle biofilm-associated infections is the limited number of molecules able to act on them at sufficiently low concentrations. For this reason, there is an intense search of biofilm inhibitors, which is often performed via the screening of compound libraries utilizing microplate assays. However, the conditions in which these assays are carried out often differ from those found in clinical environments, and for compounds to be truly effective in translational applications, they ought to be tested in relevant experimental models. This doctoral project has been focused on the development of new in vitro models that better resemble the conditions in which bacterial biofilms are formed and function in medical device-related infections (i.e. orthopedic infections and ventilator-associated pneumonia). Moreover, the anti-biofilm capacity of three previously identified biofilm inhibitors was re-assessed using the newly developed models. These biofilm inhibitors included two dehydroabietic acid derivatives, DHA1 and DHA2 and one flavan derivative, FLA1. In the clinical environment, biofilms can often be composed of multiple species, whose tolerance to antibiotic treatments may be different from those composed of single species. Because of this, in the first study, a co-culture model of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa was optimized to create a dual species biofilm. These species were chosen because they have been often co-isolated from biofilms related to numerous infections, including medical device-related ones. To be able to develop efficient treatments against multi-species biofilms, it is essential to understand the different biofilm dynamics. Because of this, as part of this study, we exhaustively characterized the variations of the proteomes (specifically the surfaceome and the exoproteome) of S. aureus and P. aeruginosa when co-existing in the same biofilm in comparison to the proteomes of these bacteria in monoculture. Moreover, the hints of several phenotypical changes derived from the proteome analysis were confirmed by a series of follow up studies, which included the analysis of their susceptibility to conventional antibiotics and to the studied compounds (DHA1, DHA2 and FLA1). Out of the three compounds tested, DHA1 was the only one preserving its activity against the S. aureus biofilm formed in co-culture with P. aeruginosa. The second and third studies aimed at assessing the applicability of these three biofilm inhibitors as part of anti-infective materials, specifically bone implanted devices and endotracheal tubes. In the specific case of implantable devices, the prevention of the infection and correct tissue integration are equally important for their success. Therefore, we first developed in the second study a model based on the co-culture of osteogenic cells (SaOS-2), and bacterial cells, specifically, S. aureus, on titanium surface. This model allowed assessing the effects of the newly identified biofilm inhibitors on their anti-biofilm capability on clinically relevant surfaces while simultaneously assessing their effects on tissue integration, apart from providing information on their effects on the interactions between these two cell types. The compound DHA1 was shown to display the best results in terms of prevention of bacterial adherence and cytocompatibility. Nevertheless, when inserting a medical device, not only the cells of the tissue (and possibly bacterial cells) are present, but also immune cells of the host. The insertion procedure often triggers an inflammatory response, which might cause an inefficient clear out of planktonic bacteria due to the efforts of immune cells being directed to degrading the foreign material. Because of this, a third model was developed based on the co-culture of bacterial and host immune cells, specifically neutrophils. This assay aimed at predicting the effects of biofilm inhibitors on the antimicrobial capacity of neutrophils. From the three compounds tested, DHA1 seemed to be the only one increasing the capacity of neutrophils in preventing bacterial adherence to the surfaces. Based upon the results obtained in the three newly developed models, DHA1 was selected to be integrated as part of 3D-printed antimicrobial coating for titanium surfaces. The functionality tests performed on the developed material confirmed its capacity in preventing S. aureus biofilm formation and its cytocompatibility, as well as its activity favoring the antimicrobial capacity of neutrophils. This doctoral research attempts to provide the science community dedicated to anti-biofilm research with new protocols able to shorten the gap between the in vitro testing and the clinical scenario. The results presented here shed some light on the dynamics of a clinically relevant dual-species biofilm, which we hope will contribute to the identification and development of new therapeutic strategies. Finally, it provides novel biofilm inhibitor candidates to be incorporated as part of medical devices, in particular a promising dehydroabietic acid derivative (DHA1) that was successfully incorporated in proof-of-concept studies, within a 3D-printed antimicrobial coating for titanium implants.Sairaalainfektiot muodostavat suuren riskin sairaalapotilaille, ja ne aiheuttavat vuosittain noin 90 000 kuolemaa yksin Euroopan Unionin alueella. Bakteeribiofilmit eli pintaan kiinnittyneet ja itse tuottamassaan matriksissa elävät bakteerien mikroaggregaatit ovat usein näiden taustalla, erityisesti lääkinnällisten laitteiden käyttöön liittyvissä infektioissa. Lääketieteelliset laitteet tarjoavat bakteereille ihanteellisen pinnan kiinnittymiseen ja biofilmin muodostamiseen, ja tähän tilaan siirtyessään bakteerit kestävät mikrobilääkehoitoa ja kykenevät välttämään isännän immuunipuolustusta. Yksi biofilmi-infektioiden torjuntaan liittyvistä haasteista on rajallinen määrä molekyylejä, jotka pystyvät vaikuttamaan biofilmeihin riittävän pieninä pitoisuuksina. Tämän vuoksi käynnissä on intensiivinen biofilmiä estävien yhdisteiden etsintä, joka toteutetaan usein seulomalla yhdistekirjastoja mikrokuoppalevymenetelmin. Näiden määritysten olosuhteet eroavat kuitenkin usein kliinisissä ympäristöissä olevista, ja jotta yhdisteet olisivat tehokkaita käytännön sovelluksissa, niitä tulisi testata asiaankuuluvissa kokeellisissa malleissa. Tässä väitöskirjatyössä kehitettiin uusia in vitro -malleja, jotka muistuttavat paremmin olosuhteita, joissa bakteeribiofilmit muodostuvat ja elävät lääkinnällisiin laitteisiin liittyvissä infektioissa (ortopedisissa infektioissa ja hengityskonehoidosta johtuvassa keuhkokuumeessa). Lisäksi kolmen aiemmin tunnistetun biofilmiestäjän tehoa arvioitiin uudelleen käyttämällä äskettäin kehitettyjä malleja. Nämä estäjät sisälsivät kaksi dehydroabietiinihappojohdannaista, DHA1:n ja DHA2:n, sekä yhden flavaanijohdannaisen, FLA1:n. Kliinisessä ympäristössä biofilmit voivat usein koostua useista lajeista, joiden sietokyky mikrobilääkehoidolle voi yhdessä olla erilainen kuin lajien esiintyessä yksin. Tämän vuoksi ensimmäisessä tutkimuksessa optimoitiin Staphylococcus aureus- ja Pseudomonas aeruginosa -bakteerien yhteisviljelymalli kahden lajin biofilmin luomiseksi. Nämä lajit valittiin, koska niitä on usein eristetty lukuisiin eri infektioihin liittyvistä biofilmeistä, mukaan lukien lääkinnällisiin laitteisiin liittyvistä infektioista. Jotta monilajisia biofilmejä vastaan voidaan kehittää tehokkaita hoitoja, on välttämätöntä ymmärtää biofilmien dynamiikkaa. Tämän vuoksi osana tutkimusta verrattiin S. aureus- ja P. aeruginosa -bakteerien proteomeja (erityisesti pinta- ja eksoproteomeja) niiden esiintyessä yksin ja rinnakkain samassa biofilmissä. Proteomianalyysistä saadut vihjeet useista fenotyyppisistä muutoksista vahvistettiin sarjalla jatkotutkimuksia, jotka sisälsivät selvityksen patogeenien herkkyydestä tavanomaisille antibiooteille ja tutkimusyhdisteille (DHA1, DHA2 ja FLA1). Kolmesta testatusta yhdisteestä DHA1 oli ainoa, joka säilytti aktiivisuutensa S. aureus -biofilmiä vastaan sen muodostettua yhteisviljelmän P. aeruginosa -bakteerin kanssa. Toisessa ja kolmannessa tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan kolmen biofilmi-inhibiittorin soveltuvuutta käytettäväksi infektioita ehkäisevissä materiaaleissa, erityisesti luuhun implantoiduissa laitteissa ja endotrakeaalisissa putkissa. Implantoitavien laitteiden kohdalla infektion ehkäisy ja oikea kudosintegraatio ovat yhtä tärkeitä hoidon onnistumisen kannalta. Siksi kehitimme ensin mallin, joka perustuu osteogeenisten solujen (SaOS-2) ja S. aureus -bakteerisolujen yhteisviljelyyn titaanin pinnalla. Tämä malli mahdollisti äskettäin tunnistettujen biofilmiestäjien tehon arvioinnin kliinisesti merkityksellisillä pinnoilla samalla, kun tutkittiin niiden vaikutuksia kudosten integraatioon. Lisäksi saatiin tietoa yhdisteiden vaikutuksista näiden kahden solutyypin välisiin vuorovaikutuksiin. Yhdisteen DHA1 havaittiin toimivan parhaiten sekä bakteerien kiinnittymisen ehkäisyn että soluyhteensopivuuden kannalta. Lääkinnällistä laitetta asetettaessa läsnä ei kuitenkaan ole vain kudoksen soluja ja mahdollisia bakteerisoluja, vaan myös isännän immuunisoluja. Implantaatio laukaisee usein tulehdusvasteen, joka saattaa heikentää irrallisten bakteerisolujen tuhoamista, sillä immuunisolujen toiminta kohdistuu patogeenin sijaan vieraan materiaalin hajottamiseen. Tämän vuoksi kehitettiin kolmas malli, joka perustuu bakteerien sekä isännän immuunisolujen, erityisesti neutrofiilien, yhteisviljelyyn. Tämän määrityksen tarkoituksena oli ennustaa biofilmiestäjien vaikutuksia neutrofiilien antimikrobiseen kapasiteettiin. Kolmesta testatusta yhdisteestä DHA1 näytti olevan ainoa, joka lisäsi neutrofiilien kykyä estää bakteerien kiinnittymistä pintoihin. Kolmessa uudessa mallissa saatujen tulosten perusteella yhdiste DHA1 valittiin sisällytettäväksi 3D-tulostettuun antimikrobiseen pinnoitteeseen titaanipinnoille. Kehitetylle materiaalille suoritetut toiminnallisuustestit vahvistivat sen soluyhteensopivuuden sekä kyvyn estää S. aureus -biofilmin muodostumista ja edistää neutrofiilien antimikrobikapasiteettia. Tämä väitöstutkimus pyrkii tarjoamaan biofilmitutkimusyhteisölle uusia menetelmiä, jotka pienentävät in vitro -kokeiden ja kliinisten olosuhteiden välistä kuilua. Työssä esitetyt tulokset myös valottavat kliinisesti merkittävän kahden lajin sekabiofilmin dynamiikkaa, minkä toivomme edistävän uusien hoitostrategioiden tunnistamista ja kehittämistä. Tutkimus esittelee uusia ehdokkaita lääkinnällisiin laitteisiin inkorporoitaviksi biofilmiestäjäyhdisteiksi, joista erityisen lupaava dehydroabietiinihappojohdannainen (DHA1) sisällytettiin koetoteutuksessa onnistuneesti 3D-tulostettuun titaani-implanttien antimikrobipäällysteeseen