Sydämen vajaatoiminta on merkittävä sairaus, joka syntyy useimmin sydäninfarktin aiheuttaman sydänsolujen kuoleman seurauksena. Sairaus on vakava; sen viisivuotiskuolleisuus on suurempi kuin monilla syövillä. Sydänlihassolukon kuolema johtaa patologiseen vasemman kammion seinämän paksuuntumiseen ja fibroosiin, jotka edelleen heikentävät sydänlihaksen toimintaa. Sydänlihassolut eivät juurikaan uusiudu, mikä pahentaa ongelmaa. Useat soluviestintäreitit ohjaavat sydämen patologista uudelleenohjelmointia, eikä reittien merkitystä sydämen vajaatoiminnan syntyyn tunneta täysin. Erilaiset sydänlihassolujen uusiutumiseen perustuvat strategiat, kuten kantasolujen suora injektointi infarktiarven alueelle, ovat menestyneet kliinisissä tutkimuksissa heikosti. Sen sijaan sydänlihaksen patologisen uudelleenohjelmoimisen estäminen pienmolekyyleillä on yhä mahdollinen keino sydämen vajaatoiminnan synnyn ehkäisemiseksi.
GATA4, eli GATAan sitoutuva proteiini 4, on sydämessä, keuhkoissa, suolistossa, sukuelimissä ja maksassa ilmentyvä transkriptiotekijä, joka aktivoi useita keskeisiä kudosten uusiutumiseen ja solunjakautumiseen vaikuttavia viestireittejä säätelemällä proteiinisynteesiä. Se sitoutuu DNA:ssa sijaitseviin GATA-jaksoihin kahden sinkkisormilenkin avulla ja käynnistää kohdegeenien luennan. GATA4:n merkittävin vaikutus on sydämessä, jossa sen vuorovaikutukset useiden muiden transkriptiotekijöiden kanssa ohjaavat sydämen kehitystä sekä sydänlihaksen paksuuntumista ja fibroosia. NKX2-5 on eräs GATA4:n kanssa synergisesti vuorovaikuttavista transkriptiotekijöistä ja tämän vuorovaikutuksen estämisen on havaittu rotan sydäninfarktimallissa ehkäisevän sydämen vajaatoiminnan syntyä. GATA4:n ja NKX2-5:n välistä proteiini-proteiini-interaktiota kohtaan on yhdisteseulontatutkimuksessa löydetty inhibiittoreita, mutta nämä yhdisteet ovat toksisia kantasoluille.
Tutkimuksen tarkoituksena oli vähentää GATA4-NKX2-5 -vuorovaikutusta estävien molekyylien kantasolutoksisuutta syntetisoimalla hit-yhdisteen johdannaisia. Hit-yhdisteen fenyyliseen renkaaseen suunniteltiin muutoksia, jotka lisäävät fenyylirenkaan elektronitiheyttä tai mahdollisesti vaikuttavat fenyyli- ja isoksatsolirenkaan välisen kiertokulman suuruuteen. Yhdisteiden aktiivisuus testattiin COS-1 -soluihin transfektoidun lusiferaasireportterijärjestelmän ja toksisuus ihmisen indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (IMR90) avulla. Toksisuuskokeiksi valittiin 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi- (MTT) ja laktaattidehydrogenaasikokeet (LDH). Uusien johdannaisten lisäksi tutkittiin viiden aiemmin syntetisoidun johdannaisen kantasolutoksisuutta samoissa kokeissa.
Kymmenen uutta johdannaista syntetisoitiin ja testattiin solumalleissa. Yhdisteistä neljä, mono- ja di-orto-metyyli-, di-meta-metoksi- sekä sykloheksyylijohdannainen, estivät reportterigeenin aktiivisuutta hit-yhdistettä vastaavalla voimakkuudella. Lisäksi mono- ja di-orto-metyylijohdannaiset sekä di-meta-metoksijohdannainen olivat hit-yhdistettä vähemmän toksisia kantasoluille MTT-kokeessa. Myös muiden yhdisteiden joukossa oli heikosti toksisia johdannaisia, mutta niiden vaikutus GATA4-NKX2-5-synergiaan oli vähäinen. LDH-kokeiden mukaan yksikään yhdisteistä ei aiheuttanut kantasoluissa merkittävää nekroottista toksisuutta.
Tutkimuksen perusteella voidaan todeta, että hit-yhdisteen fenyylirenkaan substituentteihin vaikuttamalla voidaan vähentää yhdisteen kantasolutoksisuutta. Osa muutoksista, erityisesti para-asemaan tehdyt muutokset ja fenyylirenkaan korvaaminen pienemmällä tyydyttyneellä hiilivetyrenkaalla, johti yhdisteaktiivisuuden vähenemiseen. Orto-asemaan tehtyjen muutosten vähäinen toksisuus vahvistaa hypoteesia, jonka mukaan fenyylirenkaan kiertokulma isoksatsolirenkaaseen nähden on merkittävä toksisuuden kannalta. Toisaalta, metoksiryhmän liittämisen fenyylirenkaan molempiin meta-asemoihin ei luultavasti vaikuta oleellisesti renkaan kiertokulmaan, mikä tarkoittaisi paremman siedettävyyden johtuvan muusta vaikutuksesta yhdisteen sitoutumiseen. Yhdisteiden aktiivisuus ja parantunut turvallisuusprofiili on vahvistettava eläinkokeilla, ennen kuin merkittäviä johtopäätöksiä yhdisteen rakennemuutosten vaikutuksista voidaan tehdä. Lisäksi muita toksisuuden mekanismeja tulisi tutkia solumalleilla.Heart failure is a disease of major social and economic impact. The disease is most commonly onset by extensive cardiomyocyte death following a myocardial infarction. Five-year mortality of heart failure is higher than some cancers. Loss of cardiac muscle tissue leads to pathological thickening and fibrosis of the left ventricular wall, which eventually further diminish cardiac function. Cardiomyocytes hardly proliferate, which also exacerbates the problem. Several cell signalling pathways are indicated in pathological reprogramming of the heart and the exact significance of these pathways remains to be demonstrated. Treatment strategies based on renewing cardiac muscle, such as direct injection of stem cells into the myocardium, have failed to reach clinically significant effects on heart failure patients. Direct inhibition of pathological cardiac reprogramming by using small molecule modulators remains as an auspicious strategy to treat heart failure.
GATA4, or GATA binding protein 4, is a transcription factor expressed mainly in heart, lung, intestine, gonad and liver tissues, which regulates tissue renewal and cell proliferation by controlling protein transcription. GATA4 binds to GATA sequences in DNA with two zinc finger moieties and enables transcription of target genes. Interactions of GATA4 and several other transcription factors are in central role of guiding heart development, hypertrophy and fibrosis. One of these transcription factors is NKX2-5, which synergistically interacts with GATA4. Inhibition of this interaction in rat myocardial infarction model has been shown to protect against development of heart failure. A screening campaign against the transcriptional synergy of GATA4 and NKX2-5 found potent small molecule inhibitors of this interaction, but these compounds are characterised with stem cell toxicity.
The aim of the study was to design and synthesise novel derivatives of GATA4-NKX2-5 synergy inhibitor hit molecule with reduced stem cell toxicity. Modifications on the phenyl ring of the hit molecule were designed, which either increase electron density of the ring or possibly alter the torsional angle between the phenyl and isoxazole ring moieties. Activity of the compounds was studied on a luciferase reporter gene system in COS-1 cells and toxicity was analysed on IMR90 human induced pluripotent stem cell line. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) bromide and lactate dehydrogenase (LDH) assays were selected to measure toxicity on stem cells. Stem cell toxicity of several previously synthesised compounds was assayed in parallel with the novel derivatives.
Ten novel derivatives were designed, synthesised and assayed. Four of the new compounds, a mono-ortho-methyl, a di-ortho-methyl, a di-meta-methoxy and cyclohexyl derivatives were found to be equipotent inhibitors of reporter gene activity compared to the hit compound. Additionally, the mono-ortho-methyl, di-ortho-methyl and di-meta-methoxy derivatives were less toxic to stem cells than the hit molecule in the MTT assay. Several other derivatives were found to be less toxic, but also non-active in the luciferase assay. None of the studied compounds exhibited notable necrotic toxicity on stem cells, as examined by the LDH assay.
According to this study it may be concluded that substituents of the hit molecule phenyl ring may be altered to decrease stem cell toxicity of the compound. Some of the alterations, most notably substituents in the para-position of the phenyl ring and substitution of the phenyl ring with smaller saturated hydrocarbon rings, diminish the activity of the hit compound. Remarkable toleration of ortho-substitution reinforces the hypothesis of phenyl-isoxazole torsional angle significance for toxicity. On the other hand, addition of two methoxy groups to both meta positions most likely lacks any substantial effect on the torsional angle, which implies another mechanism of toxicity avoidance. Activity and improved safety of the novel inhibitors should be confirmed in animal models before any decisive conclusions on the effects of structural modifications on the hit molecule can be made. In addition, other mechanisms of toxicity should be studied with relevant cell-based assays
