Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 01-03-2019El anticuerpo monoclonal anti-IgG1 cetuximab es una terapia que bloquea al receptor EGFR de
las células tumorales, lo que le convierte en una terapia eficaz debido al bloqueo de la ruta
molecular de las MAPK responsable de la proliferación y supervivencia celular. Además, este
fármaco posee la capacidad de activar la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC)
desencadenada por las células NK del propio paciente. Lo interesante de activar la ADCC, es que
este mecanismo es independiente de las mutaciones activadoras tanto de KRAS y BRAF, como de
cualquier otra activación de la ruta de las MAPK por debajo del EGFR. Uno de los factores que
van a determinar una mayor interacción con la fracción constante del anticuerpo cetuximab es el
tipo de polimorfismo presente en el receptor de la fracción constante de las inmunoglobulinas
presentes en la membrana de las células efectoras, en concreto FcyRIIa y FcyRIIIa. Además,
sabemos que existen otros receptores en las células NK conocidos como receptores KIR. No todos
los receptores KIR son activadores de la función de las células NK ya que estas moléculas son
polimórficas. Por esta razón, nos planteamos estudiar que polimorfismos tanto en los receptores
FcγR como en los genes KIR serían buenos marcadores predictivos de una mayor respuesta al
cetuximab a través de la activación de la ADCC. Para ello, diseñamos un ensayo clínico
multicéntrico en el que reclutamos 70 muestras de pacientes con cáncer colorrectal metastásico
con mutación de KRAS, expresión del EGFR y con el polimorfismo favorable FcγRIIa-131H/R
que fueron tratados con cetuximab. Sobre estas muestras evaluamos la expresión de los
polimorfismos en el gen de FcyRIIIa y en los genes KIR. Tras evaluar los polimorfismos de
FcγRIIIa (V158F, V158V y F158F) en nuestra cohorte de pacientes, no encontramos asociación
con la supervivencia de los pacientes tratados con cetuximab. Sin embargo, encontramos una alta
tendencia hacia la significancia con respecto a la supervivencia global asociada al gen KIR2DS4
(P=0.071). Profundizando en las variantes del gen KIR2DS4, encontramos que la variante
completa (KIR2DS4-full) presentaba un peor pronóstico comparada con la variante con el receptor
no funcional (KIR2DS4-RNF) (P=0.030).
Posteriormente, diseñamos un modelo in vitro para validar la asociación entre los polimorfismos
favorables encontrados y la capacidad de activación de la ADCC de las células NK mediante el
cetuximab. Para ello, co-cultivamos la línea celular derivada de cáncer colorrectal con mutación
de KRAS, LS147T, junto a células NK aisladas de donantes sanos positivas para los
polimorfismos favorables descritos previamente. Interesantemente, los genotipos favorables con
FcγRIIa-131(H/H ó H/R) y la variante delecionada que resulta en un receptor no funcional,
KIR2DS4del, presentaron una mayor tasa de activación de ADCC mediada por el anticuerpo cetuximab.The anti-IgG1 monoclonal antibody cetuximab is a therapy that blocks the EGFR receptor of
tumor cells. This treatment is an effective anti-neoplasic therapy to block the MAPK molecular
pathway involved in cell proliferation and survival. In addition, this drug is able to activate
antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) triggered by NK cells. Interestingly, ADCC
mechanism is independent of both KRAS and BRAF activating mutations, and other activating
factors of the MAPK pathway downstream EGFR. One of the factors that could determine the
interaction between cetuximab´s IgG1 constant fraction is the polymorphism expressed in the cell
membrane of effector T-cells called gamma chain receptor of immunoglobulin constant fraction
receptor of the immunoglobulins (FcγRIIa and FcγRIIIa). In fact, it is know that in NK cells there
are other receptors known as KIR receptors. Not all KIR receptors are activators of NK cell
function since these molecules are polymorphic. For this reason, we based our study on the
polymorphisms expressed in FcγR and KIR and dissected whether they could be good predictive
markers of cetuximab response through ADCC activation. For this, we designed a multicentre
clinical trial and recruited 70 samples from patients with metastatic colorectal cancer with KRAS
mutation, EGFR expression and the previously described FcγRIIa-131H/R polymorphism as
favorable for cetuximab response. On these samples, we evaluated the expression of the
polymorphisms in FcγRIIIa and in the KIR genes. After evaluating the polymorphisms of
FcγRIIIa (V158F, V158V and F158F) in our patient cohort, we found no association with patient
survival after cetuximab treatment. However, we found a high trend towards significance between
overall survival and KIR2DS4 (P = 0.071). Further research on this gene revealed that full variant
(KIR2DS4-full) showed a worse prognosis compared to the variant with the non-functional
receptor (KIR2DS4-RNF) (P = 0.030).
Subsequently, we designed an in vitro model to validate the association between the favorable
polymorphisms previously found, and the activation of ADCC by cetuximab. Then, we cocultured
a colorectal cancer derived cell line that carries KRAS mutation, LS147T, together with
NK cells isolated from healthy donors tested to be positive for favorable polymorphisms.
Interestingly, FcγRIIa-131 (H/H or H/R), and the deleted variant gene that translate a nonfunctional
receptor, KIR2DS4del, showed a higher activation rate of ADCC mediated by
cetuximab antibody