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Nuevas dianas moleculares de la inflamación en modelos de daño renal. Estrategias de intervención terapéutica

Abstract

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina. Departamento de Farmacología y Terapéutica. Fecha de lectura: 3-02-2017En este trabajo de tesis caracterizamos mecanismos moleculares de la inflamación renal y de respuestas accesorias inducidas por inmunosupresores de la familia de los anticalcineurínicos (ACNs) los cuales actuarían como inductoras de respuestas patogénicas asociadas a la nefrotoxicidad. En un modelo in vivo de nefrotoxicidad progresiva por CsA, observamos en el riñón incrementos de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, activación endotelial e infiltración de leucocitos desde etapas iniciales del tratamiento y de manera anticipada a la aparición de fibrosis. En este modelo, la inhibición de la quimioquina CCL20, identificada como una de las citoquinas con mayor expresión diferencial en el riñón de animales bajo tratamiento con CsA, resultó en un aparente mayor grado de inflamación y aceleración de la fibrosis. Además, el bloqueo de CCL20 resultó en menor infiltración renal de linfocitos Th17, pero no influyó en la respuesta Treg, ausente en el infiltrado inflamatorio de los ratones tratados con CsA. El bloqueo farmacológico in vivo o el tratamiento de ratones TLR4‐/‐ mejoró la inflamación, el daño tubular y la función renal de los animales tratados con CsA. En estudios in vivo e in vitro, CsA promovió la secreción de HMGB1, principal mediador endógeno de TLR4, y la inhibición del tránsito de HMGB1 impidió la síntesis de citoquinas proinflamatorias en células tubulares. La inactivación de TLR4 también inhibió la activación de la respuesta UPR ligada al estrés del retículo endoplásmico, que demostramos ser un mediador de la respuesta inflamatoria inducida por los ACNs. A nivel vascular, la inhibición farmacológica de TLR4 suprimió la respuesta inflamatoria inducida por ACNs en cultivos de células endoteliales y vasculares, y en cultivos ex vivo de aortas murinas. Una menor respuesta inflamatoria también se confirmó en aortas provenientes de ratones TLR4‐/‐ sometidas al tratamiento con ACNs. Por otra parte, en modelos inflamatorios de sepsis renal in vivo y en cultivo de células intrínsecas del riñón y macrófagos, la nanomedicina QM56 suprimió efectos proinflamatorios inducidos por señalización por TLR4 mediante la inhibición de la actividad de MAPKs. En conclusión, los ACNs desencadenan una respuesta inflamatoria renal y vascular mayoritariamente dependiente de la activación de TLR4 y que en el caso del riñón conduce a la fibrosis. Por lo tanto, TLR4 podría constituir una potencial diana terapéutica para tratamientos adyuvantes que pudieran prevenir la toxicidad renal y vascular dependiente de ACNs. Nanomedicinas de la familia de los polímeros terapéuticos podrían ser de utilidad en la inhibición de la señalización patogénica por TLR4.In this thesis work, we focused on the characterization of the molecular mechanisms of renal and vascular inflammation and associated responses induced by calcineurin inhibitors (CNIs). A murine model of progressive nephrotoxicity induced by CsA showed upregulation of renal proinflammatory cytokines and chemokines and endothelial activation proteins and also leukocyte kidney influx from early stages onwards and also previous to fibrosis onset. In this model, renal expression of the chemokine CCL20 was particularly high in CsA treated mice. Moreover, CCL20 blockade in these mice group resulted in amplification of the inflammatory process and anticipation of renal fibrosis. Moreover, CCL20 blockade led to a lesser renal Th17 lymphocyte infiltration whereas it did not affect the Treg response which otherwise remained absent in CsA‐treated mice. Both in vivo, pharmacological inhibition and the absence of TLR4 expression ameliorated CNI‐induced inflammation, tubular damage and renal function. HMGB1, the main TLR4 endogenous ligand, was secreted in response to CsA both in vivo and in vitro experimental models. Moreover, HMGB1 nuclear‐cytoplasmic transit inhibition, impeded proinflammatory cytokine expression in tubular cells. Furthermore, TLR4 suppression blocked endoplasmic reticulum stress and the unfolding protein response (UPR) activation by CNIs which participate in the CNI‐induced inflammatory response. On the other hand, TLR4 pharmacological inhibition suppressed the CNI‐induced inflammatory response in endothelial and smooth muscle vascular cells, and also in ex vivo model of mouse aorta. Experiments performed in aortas from TLR4‐/‐ mice treated with CNIs, confirmed a lower inflammatory response. Otherwise, the nanomedicine QM56 abolished the TLR4‐dependent CNI‐induced proinflammatory response through MAPK activity inhibition, both in a renal sepsis in vivo model and in relevant cell types involved in kidney injury, namely tubular and endothelial cells and also macrophages. In conclusion, results of this study show that CNIs trigger a TLR4‐dependent renal inflammatory response leading to fibrosis. In addition, TLR4 also mediated CNI inflammatory responses at the vascular level. In such a way, TLR4 could potentially be a relevant pharmacological target for adjuvant therapies aiming to prevent CNI toxic side effects. In addition, polymer‐drug conjugates nanomedicines could result in a novel therapy against pathogenic TLR4 signaling

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