Vectores virales basados en poxvirus como agentes oncolíticos

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 27-01-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 27-07-2019El cáncer supone actualmente uno de los principales problemas de salud a nivel mundial. A pesar de la efectividad de las terapias anti-tumorales empleadas habitualmente, la cifra anual de muertes asociadas a cáncer continúa siendo devastadora. A este respecto, actualmente se han obtenido tratamientos con resultados muy prometedores, encontrándose entre ellos los poxvirus y la oncolisis viral. En el presente trabajo se han desarrollado varios vectores virales candidatos basados en la cepa WR del virus vaccinia como agentes oncolíticos, en los que se ha llevado a cabo la deleción dirigida de genes para poder conseguir un virus seguro en tejidos sanos sin que las deleciones afecten al perfil replicativo en un contexto tumoral, de esta forma sacando provecho de las condiciones particulares del microambiente tumoral dadas por las marcas distintivas del cáncer. Entre los genes delecionados para conseguir dicho objetivo, se encuentran genes virales relacionados con el metabolismo de nucleótidos (A48R y J2R), factores mitogénicos (C11R), genes que intervienen en el cambio metabólico celular (C16L) o el bloqueo de la respuesta anti-viral celular (B18R y F1L). Tras la generación, caracterización y evaluación de los virus candidatos propuestos, se ha demostrado que el virus WR-Δ3-Luc, con 4 genes delecionados –A48R, B18R, C11R y J2R–, se presenta como el virus que mejor se ajusta para su uso en viroterapia oncolítica. El virus WR-Δ3-Luc ha demostrado en ensayos in vitro un comportamiento similar al virus salvaje WR, respecto a su capacidad de replicación en células primarias y tumorales, a la traducción de proteínas virales y a la inhibición de la apoptosis. En ensayos in vivo, entre los virus analizados, el virus WR-Δ3-Luc ha mostrado la mayor reducción de la virulencia; asimismo el virus mutante de deleción muestra títulos más bajos que el virus WR wt en ovarios, exudados peritoneales y cerebro en el ensayo de biodistribución tras una administración sistémica. Cuando se han analizado las poblaciones celulares del sistema inmune en el sitio de infección, el virus WR-Δ3-Luc muestra un perfil de migración similar al que presenta el virus WR wt, destacando por encima de éste último en el incremento de los niveles de migración de neutrófilos. A la hora de estudiar el comportamiento en tumores, los ensayos de trasplante de células de melanoma murino B16F10 muestran una capacidad superior del virus WR-Δ3-Luc en el control del desarrollo tumoral (por encima de la observada en con el virus WR wt); mostrando a su vez que el virus mutante de deleción WR-Δ3-Luc presenta los mismos niveles de replicación en tumor que los observados en el virus WR wt, y niveles superiores en el reclutamiento en tumores de neutrófilos y linfocitos B. Por último, se ha detectado en bazos de animales con tumores tratados con el virus WR-Δ3-Luc, linfocitos T específicos para los antígenos asociados a tumor gp100 y TRP-2, lo que demuestra la capacidad del virus candidato de romper la inmuno-tolerancia e inducir respuesta adaptativa específica frente a antígenos expresados en el tumor. Así, estos estudios ponen de manifiesto las virtudes del virus WR-Δ3-Luc en su uso potencial como vector oncolítico.Cancer is one of the major health problems plaguing our society today. The death toll attributed to cancer each year continues to be devastatingly high, despite the advent of a large number of effective anti-tumour therapies in the recent years. Some of these therapies have shown considerable promise, including those based on poxvirus and viral oncolysis. This work describes the development of viral vector candidates based on the WR strain of vaccinia virus as potential oncolytic agents. This is achieved through the targeted deletion of specific genes that, while rendering the virus safe and secure in somatic tissues, also helps the virus exploit the characteristics of a tumour micro-environment provided by the hallmarks of cancer by preserving its replication competence within the tumour. Among the genes thus deleted are those associated with nucleotide metabolism (A48R y J2R), mitogenic factors (C11R), those that intervene in the cellular metabolic programming (C16L) or block the cellular anti-viral response (B18R y F1L). Following the successful generation, characterization and evaluation of the proposed viral vectors, the WR-Δ3-Luc virus with four deleted genes (A48R, B18R, C11R and J2R) emerged as the candidate of choice for use in viral oncolytic therapy. In vitro, this virus showed similar replication capacity in primary and tumour cells, translation of viral proteins and inhibition of apoptosis to that shown by the wildtype WR virus. Among the viruses studied in vivo, the WR-Δ3-Luc virus demonstrated the greatest reduction of virulence; likewise, this deletion mutant gave lower viral titres than the wildtype WR in ovaries, peritoneal washes and cerebral tissue in a bio-distribution assay following a systemic administration. When the cellular population of the immune system at the site of infection was analysed, the WR-Δ3-Luc virus, while showing a recruitment profile similar to that of the WR, outperformed the latter in terms of the increase in the neutrophil migration levels. In studies using the B16F10 murine melanoma cells transplant, designed to understand the viral behaviour in tumours, the WR-Δ3-Luc virus demonstrated a superior capacity for controlling tumour growth (compared to that observed with the WR wt virus); while at the same time showing the same replication capacity in tumours as that of the WR wt, and higher levels of neutrophil and lymphocyte B recruitment. Finally, the presence of T lymphocytes specific to the tumour associated antigens gp100 and TRP-2 detected in the spleen of animals with tumours treated with the WR-Δ3-Luc virus highlights the ability of this viral candidate to break the immune-tolerance and to induce a tumour antigen-specific adaptive response. Therefore, these studies demonstrate the significant potential of the WR-Δ3-Luc virus as an oncolytic vector for use in therapy against cancer