Distroglicanopatías: análisis en pacientes, generación del knockout condicional de Pomt1 en fotorreceptores, y estudios genéticos y funcionales de FKTN y de FKRP en células en cultivo

Abstract

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 25 -11-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 25-05-2018Las distroglicanopatías son un grupo heterogéneo de distrofias musculares de herencia recesiva que también pueden presentar en diferentes grados afectación nerviosa y ocular. A nivel molecular se caracterizan por la pérdida de la glicosilación del alfa-­‐ distroglicano (α-­‐DG). El DG es una proteína de la matriz extracelular (MEC) formada por dos subunidades (α-­‐DG y β-­‐DG) que conecta proteínas de la MEC (p. ej. laminina, perlecano o pikachurina) con el citoesqueleto de actina, a través de su unión citoplasmática a la distrofina. La conexión con las proteínas de la MEC se realiza a través de los residuos glicosílicos, principalmente O-­‐manosilglicanos, presentes en la región mucina del α-­‐DG. Hasta la fecha, 18 genes se han relacionado con el proceso de O-­‐manosilación del α-­‐ DG. Entre ellos encontramos genes que codifican tanto glicosiltransferasas como proteínas que intervienen en la generación de compuestos intermedios de la glicosilación. La proteína O-­‐manosiltransferasa 1 (POMT1) es la primera enzima, que conjuntamente con su homóloga POMT2, introduce la manosa inicial. Este monosacárido es esencial para la generación de las diferentes estructuras glicosiladas del α-­‐DG. Por otra parte, las proteínas FKTN y FKRP son enzimas que actúan en pasos posteriores del proceso de glicosilación. Recientemente se ha descrito que ambas introducen residuos de ribitol 5-­‐fosfato en uno de los residuos del α-­‐DG. Mutaciones en POMT1, FKTN y FKRP generan desde distroglicanopatías muy graves, como pueden ser el síndrome de Walker-­‐Warburg (WWS) o la distrofia muscular congénita tipo Fukuyama (FCMD), a presentaciones clínicas más leves como las distrofias musculares de cintura tipo 2 (LGMD2). En este trabajo hemos analizado dos pacientes con sospecha de distroglicanopatía, los cuales finalmente han mostrado un déficit en la vía de autofagia con una alteración en la glicosilación del α-­‐DG. Este hecho plantea una posible relación entre la glicosilación del α-­‐ DG y esta ruta de degradación. Por otra parte, hemos generado un modelo knockout condicional de ratón para el gen Pomt1 en los fotorreceptores de la retina. Hemos demostrado cómo la mutación del gen Pomt1 está asociada a la pérdida de glicosilación del α-­‐DG, la cual genera una malformación de la sinapsis entre los fotorreceptores y la células bipolares (sinapsis ribbon) y una disfunción visual. Por último, hemos generado líneas celulares de mioblastos de ratón knockout para los genes Fktn y Fkrp. En estas células hemos realizado estudios comparativos de glicoproteómica y del perfil de expresión con el objetivo de aproximarnos a la función de estos genes de una manera indirecta. También hemos llevado a cabo estudios de la señal de retención en el aparato de Golgi de estas proteínas en las líneas silvestres y knockout.Dystroglycanopathies are a heterogenous group of recessive muscular dystrophies which can also present different grades of nervous and ocular affectation. At a molecular level, the absence of α-­‐dystroglycan (α-­‐DG) glycosylation is the main characteristic of these diseases. Dystroglycan is a matrix extracelular (ECM) protein conformed by two subunits (α-­‐DG and β-­‐DG), that conects other ECM proteins (such as laminin, perlecan or pikachurin) with the actin cytoskeleton through its cytoplasmatic connection with dystrophin. The interaction with ECM proteins is mediated by its glycan residues, mainly O-­‐ mannosylglycans, located in the mucine región of α-­‐DG. To date, 18 genes have been related with α-­‐DG O-­‐mannosylation process. These genes codified for glycosyltransferases or proteins that generate glycosylation intermediates. Protein O-­‐mannosyltransferase 1 (POMT1) is the first enzyme, together with its homologous POMT2, which introduces the inital mannose. This monosacharide is essential for the generation of different mannosylated cores. On the other hand, FKTN and FKRP are enzymes that act in posterior steps of the glycosylation process. It has recently been described that both of them introduces ribitol 5-­‐phosphate in a specific α-­‐DG core. Mutationzs in POMT1, FKTN and FKRP are able to cause from severe dystroglycanopathies, such as Walker-­‐Warburg syndrome (WWS) or Fukuyama congenital muscular dystrophy (FCMD), to less severe dystroglycanopathies like limb-­‐girdle muscular dystrophies type 2 (LGMD2). In this work, we have analyzed two patients with dystroglycanopathy suspicion. The genetic-­‐molecular characterization has finally revealed an imparment in the autophagy pathway but we have also detected α-­‐DG glyscosylation anomalies. The data seem to highlight a posible relation between autophagy and α-­‐DG. On the other hand, we have generated a conditional knockout mouse model for Pomt1 gene in the retinal photoreceptors. We have demonstrated how the mutation of POMT1 is associated with the loss of α-­‐DG glycosylation, which causes a destructing in the synapsis between both photoreceptor and bipolar cells (ribbon synapsis) and an associated visual imparment. Finally, we have generated mouse myoblast cell lines knockout for Fktn and Fkrp. In these cell lines we have performed comparative glycoproteomic and transcriptional profile analysis with the aim to approach, indirectly, to the function of these proteins. We have also analyzed the signal for Golgi retention in wild-­‐type and knockout cell lines