Characterization of pathogenicity factors of a lethal influenza A(H1N1)09 pandemic viral isolate

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 19-12-2016Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 19-06-2018Influenza virus is responsible for seasonal outbreaks that result in more than 5 million hospitalization and 500 000 deaths every year. Analysis of two clinical AH1N1pdm09 pandemic isolates originated from a patient with mild (M strain) illness and a patient that deceased (F strain) from influenza related complication during the 2009 pandemic, highlighted three amino-acid changes PB2 A221T, PA D529N and HA S127L in the F isolate, that might be responsible for the increased virulence of this strain in vitro and in vivo. Furthermore, F isolate was able to accumulate less defective genomes (DGs) than M virus during the infection in cell culture as well as in animal model. Mutations found in F strain and their effects in F virus pathogenicity were studied by introducing its changes in A/California/04/09 (CAL) virus backbone. Although these mutations did not affect viral growth or polymerase activity in vitro, we found that PB2 A221T and HA S127L attenuated while PA D529N increased the already described pathogenicity of CAL virus in vivo. Besides 100 fold decreased LD50 , CAL-PA D529N virus showed high replication rates in lungs of infected animals and strong innate immune response cell influx (neutrophils, dendritic cells, monocytes, alveolar macrophages) and inflammation in early infection (2 day post-infection). Furthermore, CAL-PA D529N virus showed great potential of viral spread to extra-pulmonary organs. Animals infected with CAL-PA D529N virus had infectious viral particles in heart tissue for a prolonged period of time (up to 4 days of infection) and at higher frequency (80% of animals) than CAL infected animals. We demonstrated that beside high viral titre, viral mRNAs of NEP, only present in cells with ongoing infection, were present in heart tissue of animals infected with CAL- PA D529N virus. Analysis of electrocardiogram (ECG) monitorization of infected animals showed that those infected with CAL-PA D529N virus suffered from systolic bradycardia and conduct cardiac defects. Accordingly with the data we obtained from studying F strain, CAL-PA D529N virus have low accumulation of defective genomes in cell culture as well as low induction of antiviral genes (MxA, ISG56). Additionally, our work shows that PA D529N mutation is able to reduce the accumulation of DGs in viruses with high DG accumulation capacity. In summary, PA D529N is responsible for increased pathogenicity of F strain. As a consequence of this mutation virus accumulates less DGs which partially delays timely antiviral response. This would allow virus to remain undetected by the infected cells for a relatively short but sufficient time period to enable viral replication. High replication rates in lungs of CAL-PA D529N virus and efficient viral spread into extra-pulmonary organs in animals increase its pathogenicity potential. These findings give us an insight into complex pathogenesis of influenza A viruses infections and the different ways it can affect final outcome of disease.El virus de la gripe es responsable de brotes estacionales que suponen más de 5 millones de hospitalizaciones y 500 000 muertos cada año. El análisis de dos aislados clínicos de la pandemia del 2009 (AH1N1pdm09), uno aislado de un paciente con síntomas leves (M) y otro de un paciente fallecido (F), puso de manifiesto la presencia de tres cambios de amino acido en el asilado F (PB2 A221T, PA D529N, HA S127L), que podrían ser los responsables de la virulencia exacerbada de este aislado. Además el aislado F presentó menor acumulación de genomas defectivos (DGs), que el aislado M tanto en viriones aislados de células en cultivo como de pulmones de ratones infectados. El papel de las mutaciones encontradas en el aislado F como posibles responsables de su patogenicidad, fue estudiado mediante la introducción de estos cambios en virus recombinantes de la cepa pandémica de referencia A/California/04/09 (CAL). Ninguna de las mutaciones afectaron la cinética de crecimiento o la actividad de la polimerasa viral in vitro, pero PB2 A221T y HA S127L atenuaron y PA D529N incrementó la patogenicidad del virus CAL en el modelo de ratón. El virus recombinante CAL-PA D529N redujo 100 veces la LD50 de los ratones infectados, mostró alta tasa de replicación en los pulmones, potente reclutamiento de células de respuesta inmune innata (neutrófilos, células dendríticas, monocitos, macrófagos alveolares) e inflamación a tiempo temprano de infección (2 días post-infección). Además, el virus CAL-PA D529N mostró un gran potencial de infección en tejidos extrapulmonares, así los ratones infectados con este virus presentaron partículas infectivas en los corazones durante más tiempo (hasta 4 días post-infección) y a mayor frecuencia (80% de los animales infectados) que los ratones infectados con el virus CAL. La presencia de partículas infectivas en los corazones, fue el resultado de replicación viral en este órgano, ya que se detectó en ellos la presencia del mRNA de la proteína NEP, que únicamente es detectada como consecuencia de replicación. La monitorización del electrocardiograma de los ratones infectados con el virus CAL-PA D529N mostró la presencia de bradicardia sistólica y defectos en la conductancia. Similarmente al aislado F, el virus CAL-PA D529N acumuló una baja cantidad de DGs en los viriones aislados de células infectadas y de acuerdo con ello una baja inducción de genes antivirales (MxA, ISG56). Adicionalmente, observamos que la mutación PA D529N reduce la producción de DGs en virus con alta tasa de acumulación de estos genomas defectivos. En conclusión el cambio PA D529N es el responsable de la patogenicidad del aislado F. El virus recombinante conteniendo este cambio, acumula una baja cantidad de DGs, lo que retrasa la respuesta antiviral. Este hecho permitiría al virus permanecer indetectable por la célula infectada por un tiempo relativamente corto pero suficiente para permitir la replicación viral. Altas tasas de replicación en pulmón en los ratones infectados con CAL-PA D529N y una eficiente dispersión a tejidos extrapulmonares incrementarían su potencial de patogenicidad. Estos resultados nos aportan datos sobre el complejo mecanismo de patogenicidad del virus de la gripe y las diferentes vías que intervienen en el resultado final de la infección.This work have been done at the Nacional Center of Biotechnology (CNB- CSIC) at the department of Cellular and Molecular Biology thanks to La Caixa International PhD Fellowship, Plan Nacional de Investigacion Científica, Desarrollo e Innovacion Tecnologica (BFU2011-26175 and BFU2014-57797-R) and the Ciber de Enfermedades Respiratorias (CIBERES)