Detecção de avelã como potencial alergénio em chocolates por técnicas de biologia molecular

Abstract

A avelã está incluída nos oito grupos de alimentos responsáveis por cerca de 90% das alergias alimentares mediadas pela IgE. Deste modo, a Comissão Europeia obriga a rotulagem de ingredientes potencialmente alergénicos, através da Directiva 2007/68/CE. De acordo com o exposto, a detecção de vestígios de avelã em produtos alimentares torna-se essencial para salvaguardar a saúde dos consumidores alérgicos. O recurso a técnicas de biologia molecular, como a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR), constitui uma opção bastante confiável para a detecção de quantidades muito baixas de um determinado ingrediente potencialmente alergénico. Com o presente trabalho procedeu-se à optimização da técnica da PCR para a detecção de avelã em chocolates. Deste modo, tornou-se necessária a comparação de diversos métodos para a extracção adequada de ADN de avelã em chocolates modelo. Numa primeira etapa do trabalho, usando primers específicos para a avelã, foi possível atingir um limite de detecção de 0,005% (50 ppm) de avelã numa matriz de massa de trigo, visando a optimização das técnicas moleculares utilizadas. Com o uso de misturas de referência de avelã em chocolate pretendeu-se, numa segunda etapa, a comparação de diferentes métodos de extracção de ADN: CTAB, Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food, NucleoSpin® Food e uso parcial do kit Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System. O método baseado no uso do kit NucleoSpin® Food foi o que evidenciou melhor eficiência em termos de reprodutibilidade e sensibilidade na amplificação por PCR convencional e PCR em tempo real com sondas TaqManTM, permitindo a detecção de 0,005% (50 ppm) de avelã em chocolate. Relativamente à detecção de avelã em amostras de chocolates comerciais, foi possível detectar, por ambas as técnicas de PCR, quantidades muito baixas de avelã em chocolates que não rotulavam a avelã como ingrediente, mas que continha a menção “pode conter vestígios de…”. Assim, pode afirmar-se que as amostras de chocolate em questão foram eventualmente contaminadas com pequenas quantidades de avelã, durante o processo de produção. Os resultados obtidos por PCR em tempo real confirmaram em geral as rotulagens das amostras de chocolate, mesmo os chocolates que não amplificaram positivamente para a avelã. Os resultados demonstram ainda que um método eficaz de extracção de ADN é a base para a obtenção de níveis de sensibilidade adequados, para detecção e quantificação de ingredientes potencialmente alergénicos, em matrizes alimentares complexas, como o chocolate. Hazelnut is included in one of the eight food groups responsible for approximately 90% of IgE-mediated food allergies. Thus, European Commission obligates the labeling of potential allergenic ingredients in foods, through the Directive 2007/68/CE. Accordingly the detection of hazelnut traces in food products becomes useful to protect allergic consumers’ health. The use of molecular biology techniques, as Polymerase Chain Reaction (PCR), is a rather reliable option to detect very low amounts of a potential allergenic ingredient. With the present work the optimization of PCR technique, aiming the detection of hazelnut in chocolate model, was achieved. Therefore, it was necessary to compare different DNA extraction methods of hazelnut in chocolate. In a first step, using hazelnut specific primers, it was possible to reach a limit of detection of 0.005% (50 ppm) of hazelnut in wheat dough. In a second step, reference mixtures of hazelnut in chocolate were used to compare different DNA extraction methods: CTAB, Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food, NucleoSpin® Food and partial use of the Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System kit. The protocol based on NucleoSpin® Food kit proved to be more reproducible and sensitive both in conventional PCR and real-time PCR amplification with TaqManTM probes, allowing a limit of detection of 0,005% (50 ppm) of hazelnut in chocolate. Concerning the detection of hazelnut in commercial chocolate samples, it was possible to detect, by both PCR techniques, traces of hazelnut in chocolates that were not labelled as containing hazelnut, but with the declaration of “may contain traces of…”. So, it can be claim that these chocolate samples were eventually contaminated with low amounts of hazelnut, during the production process. In general, the real-time PCR results confirmed the label statements, even those which were negative for hazelnut. The results of this study show that a reliable DNA extraction method is the basis for achieving adequate levels of sensitivity, for the detection and quantification of potential allergenic ingredients in complex food matrices, such as chocolate