Mancebo Fernández, Miguel Ángel

Universitat Autònoma de Barcelona. Facultat de Biociències

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• Disociación en dos componentes para evitar la inestabilidad genética que produce una transposición masiva.      ELEMENTOS MÓVILES DE ESTUDIO BIBLIOGRAFÍA 1. Skipper, K. A., et al. DNA transposon-based gene vehicles - scenes from an evolutionary drive. Journal of Biomedical Science  20:92, 1–23 (2013) 2. Coll, J. M. El Transposón SB de salmónidos como vector para transferencia de genes en vertebrados. 16 (2), 2001 3. Rubin, G. M. & Spradling, a C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218, 348–353 (1982). 4. Grabundzija, I. et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Mol. Ther. 18, 1200 –1209 (2010).  •  ¿Es posible el uso de transposones como herramienta                                                genética para la transgénesis?  INTRODUCCIÓN Elemento P Drosophila melanogaster  Tol2 Orizyas latipes Humano SB Salmónidos Humano PB Trichoplusia ni  Humano • 1. Uso a bajas concentraciones • 2. Pueden incorporar una cantidad de DNA mayor • 3. No infectan al experimentador VENTAJAS FRENTE A RETROVIRUS • 1. Incorporación de una mayor longitud de material genético (mínimo un gen) • 2. Que puedan ser movilizados por la transposasa • 3. Que tengan un uso fácil y un amplio rango de huéspedes • 4. Que su integración en los cromosomas sea eficiente • 5. Debe mantenerse estable durante posteriores generaciones REQUISITOS TRANSPOSÓN FAMÍLIA SECUENCIA DIANA PREFERENCIA DE INTEGRACIÓN CAPACIDAD DE CARGA OPI (OVERPRODUCTION INHIBITION) IMPRENTA  TRANSPOSASA HIPERACTIVA Sleeping Beauty Tc1/mariner TA 31-39% en genes ~10 kb Sí  C(A/T)GTA SB100X Tol2 hAT Aleatoria  39-48% en genes > 11 kb Limitada Aleatoria  No PiggyBac PiggyBac TTAA 47-67% en genes 100 kb Indeterminada No hyPBasa mPB INSERCIONES DE  Tol2 EN CÉLULAS HELA  • Introducción del gen ry en un embrión de Drosophila  • Embrión M, de machos M y hembras P                      (M  sin elemento P)  • Disociación en dos componentes    • Evitar la disgénesis híbrida                            (adultos estériles a causa de la inestabilidad genética por transposición masiva)3  ELEMENTO  P -- La inserción en su secuencia diana bastante aleatoria, pero a su vez se inserta en zonas cromosómicas transcrpcionalmente activas  OPI  EN CÉLULAS HELA Después del pico de transposición hay un descenso en los tres Sugiere que existe una inhibición a elevadas cantidades de transposasa Evita así la inestabilidad por transposición masiva Gráfico que muestra, a bajas cantidades de plásmido donador del gen de interés (10ng), como varía el porcentaje de máxima formación de colonias (células HeLa) con el gen insertado, en función de la cantidad de transposasa inoculada. 4  INDUCCIÓN DE CÉLULAS CD34+ HEMATOPOYÉTICAS SB100X es más eficiente que mPB en la inserción de genes para la diferenciación de estas células a granulocitos y eritrocitos. El gráfico muestra el porcentaje CFU-E/GM en función a los transposones utilizados (SB100X y  mPB) y las diferentes cantidades empleadas 4  PiggyBac Sleeping Beauty Tol2 1. No imprenta  Formación de iPSCs con factores de transcripción (Oct4)  Terapia regenerativa 2. Efecto a un bajo nº de copias  Terapia génica 3. Inserción en zonas de eucromatina 1. Es el más eficiente de los tres en vertebrados 2. Amplio rango de aplicaciones 3.   Efecto a un elevado nº de copias  Reprogramación       de células tumorales 4. Más eficiente en inducción de células multipotentes      de la línea hematopoyética 5.   Inserción en zonas heterocromatínicas    1. Inserción en zonas transcripcionalmente        activas  Silenciamiento génico 2.   Efecto a un bajo nº de copias  Terapia génica    CONCLUSIONES  •Es posible el uso de transposones en la ingeniería genética  •Ventajas evidentes frente a retrovirus •Útil y eficiente aplicación en Drosophila •Existe una inhibición  evita la inestabilidad genética •Futuro: Aplicaciones en medicina,  secuenciación, terapia génica…  Representación del mecanismo de escisión-inserción de la familia PiggyBac 1  Inserción de genes de forma transitoria Un transposón es una secuencia de DNA  que se mueve de forma autosuficiente por el genoma Retrotransposones Mecanismo de transposición: copy and paste  Transposon de DNA Mecanismo de transposición: cut and paste USO DE TRANSPOSONES COMO VECTORES EN LA  INGENIERÍA GENÉTICA MIGUEL ÁNGEL MANCEBO FERNÁNDEZ   FACULTAT DE BIOCIÈNCIES Imagen que muestra la probabilidad de la estructura nucleotídica de la secuencia diana del transposón Tol24 Imagen que muestra 113 inserciones de Tol2 en diferentes locus del genoma de células Hela4 

Uso de transposones como vectores en la ingeniería genética

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