BACKGROUND
The autoinflammatory diseases are disorders characterized by recurrent inflammatory episodes in charge of different organs. There is no apparent involvement of autoantibodies nor of antigen-specific T lymphocytes, but dysregulation of the innate immune response.
The Blau syndrome (BS) is a rare autosomal dominant autoinflammatory disease clinically characterized by symmetrical arthritis, granulomatous dermatitis and recurrent uveitis. The disease is caused by single mutations in CARD15/NOD2, encoding the NOD2 protein that is known to regulate the defense against pathogens by activating the NF-κB signalling pathway.
In this thesis, functional analysis was carried out aimed at characterizing p.E383K mutation found in one Italian family affected by Blau syndrome. After the in vitro study of mutant NOD2, we investigated the activity of NF-κB and the production of pro-inflammatory cytokines both ex vivo and in vitro.
In the second part of this thesis, we assessed in detail both the signalling pathways known to be involved in inflammation and a wide range of inflammatory mediators (pro-inflammatory cytokines and chemokines) in a cohort of patients affected by different hereditary autoinflammatory diseases such as FMF and TRAPS or complex diseases like Behçet and Adult Onset Still's disease. The aim of this studies was to increase the molecular knowledge of these disorders in order to identify possible predictive or diagnostic biomarkers for each disease and to develop future preventive and therapeutic strategies.
MATERIALS AND METHODS
For ex vivo functional analysis on Blau syndrome, peripheral blood monocyte cells (PBMC) were collected from 2 Italian patients carrying p.E383K mutation. For the evaluation of NF-κB, PBMC were lysed and analyzed by Reverse Phase Protein Array (RPPA); while for the production of mediators of inflammation (IL1β, IL6, IL8, TNFα, IFNγ, IL12, IL17, IL22, IL23), PBMC were cultured for 7 hours in presence or absence of lipopolysaccharide LPS [100ng/ml] and muramildipeptide MDP [10μg/ml] and cytokines were quantified by ELISA and antibody microarray techniques.
For the functional analysis in vitro on Blau syndrome, the starting point was the creation of 3 constructs containing cDNA of human NOD2 wild-type and mutated p.E383K and p.R334W. These plasmids were stably transfected into HEK293 cells, cultured for 7 and 24 hours in the presence or absence of MDP [10μg/ml]. The activity of NF-κB was firstly determined indirectly by evaluating the expression of IKBα and phosphorylated form in p.E383K cellular lysates by Western blotting. RPPA also assessed NF- κB activity by analysis of the expression pathway components compared to NOD2 wild-type. IL8 was assayed in the supernatants through antibody microarray technique.
In the second part of the study, serum and PBMC were collected from 40 patients with autoinflammatory diseases and 27 healthy controls. The PBMC were lysed and prepared for RPPA analysis of the major components of the NF-κB, PI3K/Akt, MAPK, JAK/STAT/c-Src and inflammasome (NALP1) signalling pathways. From the serum, mediators of inflammation (IL1β, IL6, IL8, TNFα, IFNγ, IL12, IL17, IL22, IL23) were assessed by antibody microarrays.
RESULTS
Confocal microscopy revealed that p.E383K NOD2 resides in cytoplasm of transfected HEK293 cells, as well as wild-type and p.R334W NOD2. The expression of p.E383K NOD2, assessed by Western blotting , do not present any variations after MDP stimulation. As regards the analysis of the NF-κB pathway, in vitro studies show an inactivation of this pathway in HEK293 cells presenting p.E383K NOD2, while the pathway components are upregulated ex vivo in comparison with healthy controls. Both in vitro RPPA and indirect Western blotting analysis of total lysates from p.E383K NOD2 transfected cells present lower expression of phospho IkBα than IKBα in presence or absence of MDP stimulation. No increase expression for other components of the pathway, such as phospho NF-κB and IKKα/β, was then detected, even in nuclear extracts. Concerning cytokines in Blau syndrome, both in vitro and ex vivo studies have not identified a significant increase secretion of most of the pro-inflammatory cytokines analyzed. The dosage of IL8 in vitro presents low level of the chemokine in cells expressing p.E383K NOD2. The ex vivo results of supernatants at basal level reflect the serum results for the same cytokines analyzed. Furthermore, IL17, IL22 and IL23 release is higher in patients than in controls, while IL12 is reduced in patients. The presence of the stimulus (LPS, MDP or both) does not lead to significant increases in the levels of IL1β, IL6, IL8, TNFα and IFNγ in patients compared to controls.
The search for biomarkers in autoinflammatory diseases patients shows an up-regulation of several pro-inflammatory components of the studied pathway, when compared to healthy subjects. In Behçet disease, NF-κB, PI3K/Akt, Erk1/2 MAPK pathways are statistically up-regulated, whereas in patients with Adult Onset Still's disease all analyzed pathways appear to be activated more than in controls. In TRAPS patients, many of the components of NF-κB, PI3K/Akt, Erk1/2 and SAPK MAPK, and JAK/STAT pathways are up-regulated, while for FMF patients inflammasome and Erk1/2 and SAPK MAPK pathways result activated. In Blau syndrome components of the NF-κB, p38 MAPK and PI3K/Akt pathways are up-regulated. Cytokine analysis in different autoinflammatory diseases suggests a higher release of IL8, IL22, IL23 and IL17 in all the analyzed diseases. Furthermore, all other cytokines significantly raised in patients affected by Adult Onset Still's disease. The release of TNFα and IFNγ in TRAPS patients is increased. In FMF patients, IL1β, IL6, IL8 and IFNγ levels result higher than in controls.
CONCLUSION
This is the first time that the mutation p.E383K in CARD15/NOD2 associated with Blau syndrome has been functionally evaluated. The contrasting results presented by our in vitro and ex vivo data on NF-κB pathway may indicate that the activation do not depend only on NOD2 in carriers of p.E383K mutation. Further experiments need to be done to clarify these results, using also different in vitro models. Regarding the ex vivo and in vitro studies on cytokines levels, it seems that there is not a primary mediation of IL1β and other pro-inflammatory cytokines in Blau syndrome patients carrying p.E383K, with the exception of IL17/22/23 whose role has to be deeply investigated.
This work therefore offers an insight into the molecular pathophysiology of these autoinflammatory disease. Analyses with statistical models of the signalling molecules presenting significant raised levels will be required to generate specific diagnostic algorithms and to identify valuable biomarkers to be used as targets for specific therapeutic intervention. The cytokine profiles observed may help to distinguish different autoinflammatory diseases in terms of numbers of cytokines raised. Moreover, Th17-related cytokines (IL17/22/23), significantly raised across all diseases, suggest an important role for Th17 cells in autoinflammatory diseases. Targeting Th17 cells and their related cytokines may be an effective therapeutic approach for autoinflammatory diseases in futureSCOPO DEL LAVORO
Le malattie autoinfiammatorie sono patologie caratterizzate da episodi infiammatori recidivanti a carico di differenti organi. In esse non vi è apparente coinvolgimento di autoanticorpi nè di linfociti T antigene specifici, ma disregolazione della risposta immunitaria innata.
La Sindrome di Blau (BS) è una rara malattia autoinfiammatoria autosomica dominante caratterizzata dal punto di vista clinico da artrite simmetrica, dermatite granulomatosa e uveite ricorrente. La malattia è causata da singole mutazioni nel gene CARD15/NOD2, codificante la proteina NOD2 che è nota regolare il pathway di difesa da patogeni attivando la via del segnale NF-κB.
In questo studio è stata effettuata dapprima una serie di analisi funzionali volte a caratterizzare la mutazione p.E383K ritrovata in un'unica famiglia italiana affetta da sindrome di Blau. Dopo lo studio in vitro della proteina NOD2 mutata, si è voluta approfondire l’attività di NF-κB e la secrezione di citochine pro-infiammatorie sia ex vivo che in vitro.
Nella seconda parte della tesi, si sono volute studiare nel dettaglio sia le vie del segnale note essere implicate nell'infiammazione, sia un ampio range di mediatori dell'infiammazione (citochine pro-infiammatorie e chemochine) in una coorte di soggetti affetti da differenti malattie autoinfiammatorie sia ereditarie quali FMF e TRAPS, sia complesse quali Behçet e morbo di Still nell'adulto. Lo scopo era approfondire le conoscenze molecolari di tali patologie per identificare possibili biomarcatori predittivi o diagnostici per ciascuna malattia e sviluppare in futuro strategie terapeutiche mirate e preventive.
MATERIALI E METODI
Per l'analisi funzionale in vitro sulla sindrome di Blau, punto di partenza è stato la produzione di 3 costrutti contenenti cDNA umano di NOD2 wild-type e mutato p.E383K e p.R334W. Questi costrutti sono stati trasfettati stabilmente in cellule HEK293, poste poi in coltura per 7 e 24 ore in presenza o assenza di muramildipeptide MDP [10μg/ml]. L’attività di NF-κB è stata determinata dapprima indirettamente valutando l’espressione di IKBα e forma fosforilata nelle cellule mutagenizzate p.E383K mediante Western blotting dei lisati cellulari. In seguito mediante Reverse Phase Protein Array (RPPA) è stata valutata l'espressione dei componenti del pathway rispetto a NOD2 wild-type. É stata inoltre dosata l'IL8 nei surnatanti delle colture mediante tecnica antibody microarray.
Per l'analisi funzionale ex vivo relativa alla sindrome di Blau, sono stati analizzati 2 soggetti italiani affetti e portatori della mutazione p.E383K, da cui sono state estratte le cellule monocitarie del sangue periferico (PBMC). Per la valutazione dell'attività NF-κB, i PBMC sono stati lisati e analizzati mediante RPPA. Per la produzione di citochine (IL1β, IL6, IL8, TNFα, IFNγ, IL12, IL17, IL22, IL23) i PBMC sono stati invece posti in coltura per 7 ore in presenza o assenza di agenti di stimolo quali lipopolisaccaride LPS [100ng/ml] e di muramildipeptide MDP [10μg/ml] e le citochine sono state dosate mediante tecnica ELISA e antibody microarray.
Nella seconda parte dello studio, sono stati presi in esame 40 pazienti affetti da malattie autoinfiammatorie (Behçet, Still nell'adulto, FMF, TRAPS e Blau in particolare) e 27 controlli sani, dai quali sono stati raccolti siero e PBMC. Quest'ultimi sono stati lisati e preparati per l'analisi RPPA dei maggiori componenti delle vie del segnale NF-κB, PI3K/Akt, MAPK, JAK/STAT/c-Src e inflammasoma (NALP1). Dal siero sono state dosate IL1β, IL6, IL8, TNFα, IFNγ, IL12, IL17, IL22, IL23 mediante antibody microarray.
RISULTATI
La microscopia confocale ha evidenziato una pronunciata presenza di p.E383K NOD2 nel citoplasma delle cellule HEK293 trasfettate, così come per NOD2 wild-type e mutato p.R334W. L'espressione di p.E383K NOD2, valutata mediante Western blotting, non presenta variazioni in seguito a stimolazione con MDP per 7 o 24 ore. Per quanto concerne l'analisi del pathway NF-κB, lo studio in vitro presenta una mancata attivazione nelle cellule HEK293 presentanti p.E383K NOD2, mentre il pathway risulta upregolato ex vivo rispetto ai controlli sani. In vitro infatti si nota un'inferiore espressione di IKBa fosforilato rispetto a IKBa in presenza o assenza di stimolazione MDP, sia nell'analisi indiretta con Western blotting sia mediante RPPA dei lisati totali delle HEK293 trasfettate con p.E383K NOD2. Non è stato rilevato poi alcun incremento di espressione per altri componenti del pathway, quali la forma fosforilata di NF-κB, IKKα/β, anche nell'estratto nucleare. Sia lo studio in vitro che quello ex vivo non hanno identificato un incremento significativo, sia a livello basale che in seguito a stimolazione, di secrezione della maggior parte delle citochine pro-infiammatorie analizzate. Il dosaggio di IL8 in vitro presenta bassi livelli citochinici nelle cellule esprimenti p.E383K NOD2. I risultati basali ex vivo da surnatante rispecchiano quanto osservato da siero per le medesime citochine analizzate. Inoltre si è notato un rilascio di IL17, IL22 e IL23 maggiore nei pazienti, unitamente ad un minor rilascio di IL12, rispetto ai controlli. La presenza di stimolo (LPS; MDP o entrambi) non ha portato a incrementi significativi dei livelli di IL1β, IL6, IL8, TNFα e IFNγ nei pazienti rispetto ai controlli.
La ricerca di biomarcatori nei pazienti affetti da malattie autoinfiammatorie ha evidenziato una up-regolazione di molti componenti pro-infiammatori dei pathwy studiati, quando comparati a soggetti sani. Nella malattia di Behçet, le vie metaboliche NF-κB, PI3K/Akt, Erk1/2 MAPK sono risultate statisticamente up-regolate, mentre nei pazienti affetti da Still dell'adulto tutti i pathway analizzati risultano essere maggiormente attivati rispetto ai controlli. Nei pazienti TRAPS, presentano livelli aumentati molti dei componenti dei pathway NF-κB, PI3K/Akt, Erk1/2 e SAPK MAPK, e JAK/STAT, mentre per i pazienti FMF si nota l'attivazione del pathway legato all'inflammasoma e di quello Erk1/2 e SAPK MAPK. Nella sindome di Blau sono invece risultati upregolati componenti dei pathway NF-κB, PI3K/Akt e p38 MAPK.
Dall'analisi citochinica nelle differenti malattie autoinfiammatorie si evince un maggior rilascio di IL18, IL22, IL23 e IL17 in tutte le patologie analizzate. Inoltre si è notato un incremento significativo dei livelli di TNFα e IFNγ nei pazienti TRAPS, di IL1β, IL6 e IFNγ nei pazienti FMF e di tutte le citochine in analisi nei pazienti affetti da Still dell'adulto.
DISCUSSIONE
Questa è la prima volta che viene studiata a livello funzionale la mutazione p.E383K nel gene CARD15/NOD2 associato alla sindrome di Blau. Per quanto riguarda il pathway NF-κB, i risultati contrastanti ottenuti in vitro ed ex vivo, possono indicare come l'attivazione non sia regolata solamente da NOD2 per i portatori della mutazione p.E383K. Ulteriori esperimenti saranno necessari per chiarire questi risultati, utilizzando anche differenti modelli cellulari in vitro. I risultati ex vivo e in vitro relativi al dosaggio citochinico non sembrano evidenziare un coinvolgimento primario di IL1β e delle altre citochine proinfiammatorie nella patogenesi della sindrome di Blau,ad eccezione di IL17/22/23, il cui ruolo dovrà essere studiato più approfonditamente.
Questo lavoro di tesi offre inoltre una panoramica della patofisiologia molecolare di differenti malattie autoinfiammatorie. Un'analisi approfondita dei componenti dei pathway individuati con elevati livelli di espressione rispetto ai controlli sani sarà necessaria per identificare validi biomarcatori da poter utilizzare come target terapeutici. I profili citochinici ottenuti possono essere d'aiuto nel discriminare le differenti patologie sulla base di quali citochine presentino dosaggi maggiori rispetto ai controlli. Inoltre, IL17 IL22 e IL23 presentano livelli significativamente più elevati in tutte le malattie analizzate, suggerendo un importante ruolo nelle autoinfiammatorie per le cellule Th17 secernenti tali citochine. Utilizzare le cellule Th17 e le citochine ad esse associate come target terapeutico potrebbe essere in futuro un nuovo approccio nella cura delle malattie autoinfiammatori
