Cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) plays an important role in livelihood of the people and the economic status in Taiwain. In summer, the high temperature and humidity cause very serious problem and plant diseases in combination with pests and insects. Development of cabbage varieties with more disease-resistant is considered to be of great economic importance in Taiwan. Biological control of plant diseases and plant pathogens represents an attractive alternative as well as is of great significance for the future. A two-component cell lysis cassette composed of holin and lysozyme genes have been isolated and characterized from phytopathogenic bacteria Xanthomonas from Dr. Ming-Te Yang's laboratory. By using the system of daao gene as marker genes and followed by elimination of marker gene, we attempt to engineering the phage lysozyme (lys) and holin (hol) genes into the cabbage chloroplasts. The objective of this study is to engineer transplastomic cabbage with a high level of resistance against plant disease using the approach of the marker gene-free technology. In this study, four chloroplast transformation vectors (pMT91-GHD, pMT91-GHsD, pMT91F-GL-sD, pMT91F-EL-sD) harboring the daao as selectable marker genes and lys or hol as target genes were transferred into cabbage chloroplast via biolistic bombardment. The regenerated plants were primarily selected by 100-200 ppm D-alanine and further confirmed by PCR and RT-PCR. The results of PCR and RT-PCR analysis indicated that transformed genes (hol, lys, gus, and egfp) were integrated into the plastid genome of transplastomic plants, and its mRNA was expressed. The selectable marker gene daao had been eliminated in several transgenic plants. Preliminary results showed that disease resistance existed in the lys or hol gene transplastomic plants after inoculation with Xanthomonas campestris pv. campestris 11 (Xc 11).甘藍為台灣重要蔬菜之一，於 2013 年農業統計年報導栽培面積約七千 多公頃，是種植面積最廣的葉菜類蔬菜，有其重要的民生及經濟地位，因此 改善其品質及增加生產，一直是蔬菜專家努力的目標。台灣夏季高溫多雨， 造成病蟲害的快速蔓延，使得農民噴施農藥的次數及劑量增加，造成農藥殘 留量上升，病蟲產生抗藥性，甚至破壞生態平衡的情形。確保全球糧食的不 虞匱乏及促進人類的健康，要如何使健康糧食作物增產，是目前農業科學家 重要課題之一。溶菌酶 (lysozyme, lys)使細菌的細胞壁中肽聚糖網狀結構崩 壞，進而破壞細菌的細胞壁，使細胞膜因內部透壓過大而破滅死亡。穿孔素 (holin, hol)形成的孔道可使溶菌酶通過到達細胞壁肽聚醣層發揮裂菌功能。 本研究乃結合所建立的 daao 基因作為葉綠體篩選標誌基因系統，及剔除篩 選標誌基因之無篩選標誌基因的葉綠體基因轉殖系統，分別將穿孔素基因 (hol)及溶菌酶基因 (lys)轉殖到'初秋'甘藍葉綠體基因組中，探討利用基因工 程育成抗病甘藍的可行性。 本研究將分離自 Xanthomonas fragariae (草莓角斑病菌)菌株的類似噬菌 體 (phage XF)的溶菌酶 (lys)及穿孔素 (hol)基因，並構築到甘藍葉綠體基因 轉殖之四種載體 (pMT91-GHD、pMT91-GHsD、pMT91F-GL-sD、pMT91F- ELsD)，利用基因槍轟擊法轉殖到'初秋'甘藍下胚軸的葉綠體。再生殖株利用 100~200 ppm 之 D-alanine 持續篩選，已獲得四種轉殖系的再生植株 (GHD、 GH-sD、GL-sD 及 EL-sD)。再生植株以 PCR、RT-PCR 分析，結果顯示 hol 與 lys 目標基因、gus 與 egfp 報導基因已存在甘藍葉綠體基因組中並表現其 mRNA；部份轉殖植株之 daao 篩選基因已經被惕除。接種十字花科黑腐病 菌後，部份轉殖植株呈現明顯的具抗病特性。本研究初步結果顯示，利用葉 綠體基因轉殖系統，轉殖溶菌酶基因 (lys)及穿孔素基因 (hol)，培育出抗病 甘藍是可行的。中文摘要………i
英文摘要………ii
目次………iii
圖目次………v
前言………1
前人研究………3
一、葉綠體基因轉殖………3
二、葉綠體應用現況………5
(一)、改善作物性狀………5
(二)、生產醫用蛋白及疫苗………6
三 植物抗細菌蛋白基因轉殖之應用………6、
(一)、天蠶素 Cecropin………7
(二) 攻擊素 Attacin………8、
四、 蕓苔屬蔬菜作物基因轉殖應用………8
(一)、抗非生物逆境之研究………9
1、 非酵素型防禦系統應用………9
2、 酵素型防禦系統應用………9
(二) 、抗生物性病害逆境之研究………10
1、 破壞病原菌細胞結構………10
2、 抗病相關基因………11
(三) 、抗生物性蟲害逆境之研究………11
1.蘇力菌毒蛋白之應用………12
2.蛋白酶抑制劑應用………12
五、 溶菌酶簡介及應用………12
(一) 、溶菌酶分類………12
(二) 、溶菌酶主要作用機制………13
(三) 、溶菌酶酵素共價鍵作用位置………13
(四) 、溶菌酶酵素基因轉殖到植物之研究………13
六、 穿孔素………14
材料與方法………16
結果………25
一、 轉殖載體分析………25
二、 甘藍培殖體 D-alanine 篩選濃度試驗………26
三、 甘藍葉綠體基因轉殖、培殖體篩選及誘導再生………26
四、 轉殖甘藍植株基因表現、GUS 活性分析、病原菌接種測試……27
討論………50
參考文獻………5
