Construction of an ORF34 deletion φCh1 strain and secretion of putative tail fibre proteins

Abstract

Der Virus φCh1, welcher das haloalkaliphile Archaeon Natrialba magadii infiziert, besitzt eine spezialisierte Gensequenz mit einem invertierbaren Bereich. Dieser umfasst die mutmaßliche Invertase int1, flankiert von den beiden offenen Leserahmen 34 und 36 welche nach einer Inversionsreaktion zu unterschiedlichen Genprodukten führt, die als putative „tail fibre“ Proteine dienen sollen und durch die entstehende Vielfalt ein erweitertes Wirtspektrum sicherstellen sollen. Dieses Ereignis führt unter anderem zu einem Austausch der 3´Enden von ORF34 und ORF36 wobei das Genprodukt 3452 entsteht und frühere Studien konnten die Interaktion mit der Zelloberfläche von Nab. magadii nachweisen (Klein et al., 2010). In diesem Zusammenhang wurde im Zuge dieser Arbeit eine Deletionsmutante dieser fraglichen Region ORF34 hergestellt, wobei die Abwesenheit des vermeintlichen „Infektionswerkzeuges“ des Viruses φCh1 einen Verlust der Infektion zur Folge haben sollte. Dieser Nab. magadii L11-ΔORF34 Stamm wurde mittels homologer Rekombination mit einer Novobiocin Kassette hergestellt. Die Abwesenheit dieses Produktes wurde anhand Western Blot nachgewiesen und die Bestätigung eines homozygoten Stammes wurde mit einem Southern Blot durchgeführt. Nachdem festgestellt wurde, dass keine intakten Virus Partikel freigesetzt werden konnten, wurde auf das Vorhandensein des Hauptcapsidprotein E getestet. Dieses Protein ist unter anderem für das Entlassen von reifen Viren verantwortlich. Es konnte keine Expression nachgewiesen werden und lässt daraus schließen, dass die eingefügte Mutation den Leserahmen der Transkription beeinflusst und somit keine gänzlich funktionierende Virus Partikel produziert. Im Anschluss wurde versucht die ursprüngliche Funktion dieser „Knock out“ Mutante L11-ΔORF34 durch das Einbringen einer funktionellen Sequenz, welche für das Genprodukt 3452 kodiert, widerherzustellen. Für diese Komplementationsanalyse wurden die Transformanten unter Durchführung eines Phagen Titers untersucht wobei resultierende Plaques auf wieder intakte wild typ Viren schließen lässt. Es konnte keine Plaque Formation nachgewiesen werden und somit keine funktionstüchtigen Viren. Um diesen Einfluss der Deletion auf nachfolgende Genexpression unter Kontrolle zu halten, soll ein zusätzliches Stopp-codon, spezifisch für Archaea, eingefügt werden und weiter Erfolge versprechen. Der zweite Teil dieser Arbeit umfasst ein weiteres Experiment welches die Funktion des Genproduktes 3452 als „Infektionswerkzeug“ nachweisen soll. Dafür wurde ein weiteres Produkt dieser bereits erwähnten Inversionsreaktion ausgewählt (Genprodukt 341) von dem bekannt ist, dass es nicht an die Zelloberfläche von Nab. magadii bindet. Das Ziel war es, durch Sekretion beider Genprodukte 341 und 3452 aus Nab. magadii die Infektion des wildtyp Virus φCh1 zu verhindern oder einzuschränken. Dies wurde mithilfe der Natrialba Extrazellulären Protease (Nep) durchgeführt. Es ist bekannt, dass dieses proteolytische Enzym zu Beginn der Stationären Phase autokatalytisch expremiert und prozessiert wird, wobei der N-Terminus während des Exportes abgespalten wird um die Protease in den Extrazellulären Raum zu entlassen (De Castro et al., 2008). Diese Eigenschaften wurden als Hilfsmittel zum Export der vermeintlichen „tail fibre“ Proteinen genutzt und Konstrukte hergestellt, welche den N-Terminus der Protease fusioniert mit den jeweiligen Varianten der Inversionsprodukte von ORF34/36 tragen. Diese Konstrukte wurden in den Stamm Nab. magadii P3 transformiert welcher defizient für diese Protease ist und mittels Western Blot konnte die erfolgreiche Sekretion dieser Proteine nachgewiesen werden. Die anschließende Durchführung eines Phagen Titers, wobei die exportierenden Stämme Nab. magadii P3 (pNB102 pNPro-341), Nab. magadii P3 (pNB102 pNPro-3452) und Nab. magadii P3 (pNB102, leerer Vektor) mit dem wild typ Virus infiziert und mit der Infektionsrate des Kontrollstammes Nab. magadii P3 (pNB102) verglichen wurden. Die Ergebnisse zeigten eine Reduktion der Infektionsrate des Stammes Nab. magadii P3 (pNB102 pNPro-3452). Dieser Stamm exportiert das vermutete „tail fibre“ Protein welches an die Zelloberfläche binden kann und lässt die Infektionsrate im Vergleich zum Kontrollstamm Nab. magadii P3 (pNB102) mindestens um ein Achtfaches sinken und etwa eine Fünffache Abnahme der Infektion konnte bei einer Gegenüberstellung mit dem Stamm Nab. magadii P3 (pNB102 pNPro-341) festgestellt werden. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich die bereits angestellte Vermutung, dass das Genprodukt 3452 eine essentielle Rolle im Infektionsprozess des Viruses φCh1 mit Natrialba magdii spielt.The virus φCh1, which infects the haloalkaliphilic archaeon Natrialba magadii contains an invertible genomic region where a recombination event leads to an exchange of the 3´ends of the convergent open reading frames (ORFs) 34 and 36. During the lysogenic life cycle, this inversion reaction yields in various gene products coding for putative tail fibre proteins. Increased emphasis has been put on two selected products of ORF34, the non-inverted variant gp341 and the variant comprising the C-terminus of gp36 gp3452. Previous studies identified that just gp3452 is able to bind to the cell surface of Nab.magadii, the only known host of φCh1, yet (Klein et al., 2012). The aim of this work was another confirmation of the protein gp3452 as a putative tail fibre protein. Therefore an ORF34 deletion mutant was created by homologous recombination, using a selection cassette (NovR) for gene replacement. Per Western blot and Southern blot the absence of the respective gene product and homozygation of the strain L11ΔORF34 respectively, were demonstrated. However, the elimination of ORF34, which is supposed to represent the sequence of encoded putative tail fibre proteins, yielded no mature phage particles. Furthermore, the presence of the major capsid protein E, which is thought to be essential for release of progeny precursors from the host membrane, could not be detected by Western blot analysis. This result may explain why the deletion mutant Nab. magadii L11ΔORF34 is not able to enter the lytic life cycle. By introducing a sequence expressing ORF3452 it was tested if the deletion mutant is able to recover wild type behavior. The complementation application was performed with investigation of potential plaque formation, which would be due to regained infectivity of the mutant virus. However, complementation of the mutant strain resulted in no plaque formation. It is presumably that the introduced deletion mutation affects transcription. In order to achieve a proper transcription, an archaeal termination sequence integrated in the deletion construction sequence might be an approach. In the second part of this work, an experiment was performed in order to prevent infection of the virus ФCh1 with the purpose of occupying the receptors on the Nab. magadii cell surface, by exporting the protein variants of gp34 (gp341 and gp3452). Therefore, Nep (Natrialba extracellular protease) was used as facility for secretion of the putative tail fibre protein by fusion of the respective proteins with the N-terminus of the protease. Those in frame fusion constructions were transformed by a shuttle vector into Nab. magadii P3, a protease deficient strain. The autocatalytically features of Nep enables to export the putative tail fibre proteins without residues from the N-terminus of the protease because of the cleavage, before export occurs. The confirmation of a successful secretion was performed by western blot analysis which was followed with an infectivity analyses with the wild type φCh1. The results showed that the strain Nab. magadii P3 (pNB102 pNPro-3452) exporting the putative tail fibre protein gp3452 yielded a reduction of infectivity of at least 8 orders of magnitude compared to the control strain Nab. magadii P3 (pNB102) and 5 orders of magnitude compared to Nab. magadii P3 (pNB102 pNPro-341), indicating that infectivity of φCh1 can be hindered by occupying the receptor with gp3452.These results gave another hind, that gp34 acts as a tail fibre protein