可溶性澱粉合成酶（soluble starch synthase, SSS）是高等植物中參與澱粉合成的重要酵素。本論文利用檳榔心芋（芋，Colocasia esculenta var. esculenta）做為材料，進行其SSSI及SSSII cDNA的選殖、表現與特性分析，以探討它們在澱粉合成中所扮演的角色。
本研究利用RT-PCR與rapid amplification of cDNA ends（RACE）的方法，自芋葉組織中選殖出SSSI cDNA。SSSI在芋基因體中是單一拷貝的基因，其cDNA長度為2340 bp，包含643個胺基酸序列之閱讀框架，其中前54個殘基為訊息胜肽（transit peptide）。而芋SSSI在Escherichia coli中所表現的重組蛋白質，具有primer-dependent及primer- independent二種澱粉合成酶的活性。另一方面，芋SSSI在葉組織表現較多，塊莖表現較少，而葉柄中則未觀察到其表現。同時，在澱粉快速積存生長期的塊莖-- 597± 37g重的塊莖，發現較多的SSSI mRNA及蛋白質表現量。在葉組織發現72 及66 kDa兩種SSSI，但在塊莖組織只有66 kDa SSSI。此外，芋SSSI有一較特殊的性質，是其只存在塊莖萃取物的可溶性部分，不像其它已發表的SSSI會同時存於可溶性與澱粉顆粒的部份。
芋SSSII cDNA亦以相同方法自芋塊莖中選殖出來。其長度為2939 bp，包含804個胺基酸序列之閱讀框架，其中前52個殘基亦為訊息胜肽。芋SSSII演譯的胺基酸序列與其他物種的SSSII，有58- 63%的相同性及63- 69%的相似性。雖然芋是單子葉植物，但比對及親緣的分析結果，均顯示其與同為單子葉來源的SSSII較不相似，反與雙子葉植物的SSSII較為相近。而SSSII在E. coli中表現出具有澱粉合成活性的重組蛋白質，更確定其為芋中的一個澱粉合成酶。南方墨漬法結果顯示，其在芋基因體可能是單一拷貝數或低拷貝數基因。另一方面，在澱粉快速積存生長期的塊莖-- 597± 37g重的塊莖，可發現較多的SSSII mRNA及蛋白質。西方墨漬法分析結果顯示，芋SSSII同時存於塊莖萃取物的可溶性與澱粉顆粒的部份，且其在老化葉中有較多的表現量。這些結果顯示芋SSSII是一種特殊的澱粉合成酶，其同時參與芋暫存性與儲藏性澱粉的合成。Soluble starch synthase (SSS) is one of the important enzymes involved in the starch synthesis of higher plants. In this thesis, we used Bin Lang Hsin Yu (taro, Colocasia esculenta var. esculenta) as material to precede the cloning, expression and characterization of SSSI and SSSII for studying their functions in starch synthesis.
SSSI cDNA was isolated from taro leaves by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends reaction (RACE). The cDNA of this single copy gene is 2340bp and encodes a 643 amino acid protein containing a putative transit peptide of 54 residues. Recombinant SSSI protein displayed both primer-dependent and primer-independent activities of starch synthase. More SSSI transcript was expressed in taro leaves than in tubers, with no evident expression in petioles; and more transcript and protein were found in tubers of 597 37g fresh weight than in smaller or larger ones. Two forms of SSSI, i.e., 72 and 66 kDa, exist in leaves, but only the 66 kDa form is found in tubers. The taro SSSI, proposed as a novel member, was located only in the soluble fraction of tuber extract, while SSSI from other sources exist in both soluble and granule-bound forms.
A novel SSSII cDNA was isolated from taro tubers by the same cloning method. This 2939 bp SSSII cDNA encodes a 804 amino acid protein with a putative transit peptide of 52 residues at the N terminus. It displays 58- 63% identity and 63- 69% similarity with SSSIIs from other sources. Alignment and phylogenetic analyses showed that taro SSSII is more closely related to dicot SSSIIs than the monocot ones, though taro is a monocot. The identification of taro SSSII clone as starch synthase was confirmed by the expression of its enzymatic activity in Escherichia coli. Genomic DNA blot analysis revealed a single copy or low copy number of SSSII in taro. Expression profile showed that more transcript and protein were highly accumulated in tubers of 597 37 g fresh weight, at a stage of rapid starch synthesis, than tubers of other stages. By Western blot analysis, SSSII was found in both soluble and granule bound portions of tuber extracts; and more SSSII protein was found in aged leaves than leaves of other stages. These results suggested that taro SSSII is a novel starch synthase for the synthesis of both transit and storage starch.目 錄
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目錄 i
縮寫表 v
摘要
中文摘要 vii
ABSTRACT ix
第一章 緒論 1
第一節 澱粉顆粒之組成與結構 1
第二節 澱粉合成代謝途徑 4
第三節 澱粉合成酶之作用機制 5
第四節 可溶性澱粉合成酶之相關研究 6
第五節 芋之簡介 9
第六節 實驗緣由與目的 10
第二章 材料與方法 12
第一節 芋之來源與採樣之處理 12
第二節 Escherichia coli宿主 12
第三節 質體 14
第四節 藥品 14
第五節 儀器與設備 15
第六節 實驗方法 16
1 芋SSS之分離 16
1.1 粗酵素液之製備、硫酸銨劃分區分及膠體過濾層析分離 16
1.2 澱粉合成酶活性之測定 17
1.2.1 Primer-dependent activity 17
1.2.2 Primer-independent activity 18
1.2.3 酵素活性單位 19
1.3 電泳分析 19
1.4 蛋白質含量之測定 20
1.5 活性染色 20
2 芋SSS基因之選殖 21
2.1 芋之RNA的抽取與分析 21
2.1.1 芋之總體RNA（total RNA）的抽取 21
2.1.2 甲醛瓊脂膠體電泳分析法 23
2.1.3 mRNA之回收 24
2.2 以RT-PCR、5’及3’ cDNA尾端快速增殖法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）選殖SSS基因 24
2.2.1 利用反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應（reverse transcriptase- polymerase chain reaction, RT-PCR）方法增殖部分SSS cDNA片段 25
2.2.2 以3’-RACE方法分析SSSs基因之3’端序列 26
2.2.3 以SMARTTM RACE分析SSSs基因之5’端序列 27
2.2.4 cDNA片段之回收 28
2.2.5 TA選殖（cloning） 29
2.2.6 全長SSSs基因之選殖與表現系統之構築 29
2.2.7 轉形作用 29
2.2.7.1 CaCl2方法 30
2.2.7.2 電穿孔法 30
2.2.8 質體DNA之抽取 31
2.2.9 生物資訊學之分析 32
3 SSS表現系統之構築 33
3.1 以PCR方式增殖SSSI及SSSII上具閱讀框架的cDNA片段 33
3.2 內切限制酶之剪切與DNA接合作用 34
3.3 DNA分子端之補齊（3’端位配對之補齊） 34
4 重組SSS之生產與純化 35
4.1 重組SSSI蛋白質之生產 35
4.2 細胞浸噬液的製備 35
4.3 重組SSSI蛋白質之純化 36
4.3.1 變性條件下之純化 36
4.3.2 可溶性蛋白質之純化 37
4.4 重組SSSII蛋白質之生產 38
4.5 重組SSSII蛋白質之純化 38
4.6 抗體之製備 39
5 芋中SSSI及SSSII性質之分析 40
5.1 芋之總蛋白質抽取 40
5.2 芋SSSs分佈之部位 41
5.3 二維電泳分析 42
5.4 西方墨漬法分析 42
5.5 芋基因體DNA之抽取 43
5.6 南方墨漬法 44
第三章 結果與討論 46
第一節 芋之澱粉合成酶 46
一 芋澱粉合成酶之分佈 46
二 芋塊莖中可溶性澱粉合成酶之分離 46
第二節 芋SSSI基因之研究 52
一 芋SSSI基因之選殖 52
二 芋SSSI cDNA之序列與胺基酸序列之生物資訊學分析 55
三 芋SSSI基因在Escherichia coli之表現、生產與純化 62
四 芋SSSI基因性質之分析 76
第三節 芋SSSII基因之研究 83
一 芋SSSII基因之選殖 83
二 芋SSSII cDNA之序列與胺基酸序列之生物資訊學分析 83
三 芋SSSII基因在Escherichia coli之表現、生產與純化 92
四 芋SSSII基因性質之分析 98
第四章 結論 104
第一節 芋澱粉合成酶之分佈與同功酶數目之鑑定 104
第二節 芋可溶性澱粉合酶cDNA的選殖與選殖cDNA的分析 104
第三節 芋可溶性澱粉合成酶於 Escherichia coli 表現系統中之表現、生產及純化與抗體製備 107
第四節 可溶性澱粉合成酶在芋植物中之表現 110
第五節 未來展望 111
第五章 參考文獻 113
附錄一 124
附錄二 12
