Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus merupakan bakteri yang resisten terhadap antibiotik atau disebut Multi Drugs Resistance (MDR). Bakteri tersebut menimbulkan berbagai penyakit pada manusia dan hewan. Eksplorasi dan pengembangan sumber antibiotik baru sangat diperlukan, salah satunya yang berasal dari spons laut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekstrak spons dari Perairan Kupang, Nusa Tenggara Timur yang memiliki potensi antibakteri tertinggi, serta mampu mengetahui jenis spons. Penelitian ini menggunakan cara ekstraksi dengan maserasi kemudian ekstrak diuji terhadap bakteri patogen. Ekstrak dengan zona hambat terbaik difraksinasi denganseparatory funnel dan Kromatografi Kolom Terbuka (KKT), kemudian diuji kembali aktivitas antibakterinya. Maserasi menghasilkan ekstrak kasar spons sebesar 0,48 % sampai dengan 5,19 %. Uji pendahuluan terhadap bakteri patogen menggunakan metode difusi agar menunjukkan bahwa spons K14-52 memiliki potensi antibakteri paling tinggi dengan zona hambat sebesar 10,43±0,26 mm terhadap bakteri E. coli dan 9,38±0,57 mm terhadap bakteri S. aureus pada konsentrasi 500 μg/disk. Fraksinasi ekstrak dengan Kromatografi Kolom Terbuka (KKT) menghasilkan empat fraksi dan diuji aktivitas antibakterinya pada konsentrasi 100 μg/disk, 50 μg/disk, dan 25 μg/disk. Fraksi 2 menghasilkan zona hambat tertinggi sebesar 10,9±0,02 mm terhadap bakteri E. coli dan 9,62±0,31 mm terhadap bakteri S. aureus pada konsentrasi 100 μg/disk. Visualisasi KLT menggunakan Vanilin asam sulfat dan Ninhydrin menunjukkan bahwa fraksi 2 mengandung golongan senyawa asam lemak dan alkaloid. Identifikasi secara makroskopis dan mikroskopis menunjukkan bahwa spons K14-52 masuk dalam kelas Demospongia, dengan spesies Rhabdastrella globostellata. Spons tersebut memiliki makrosklera monoaxon spikula (Hastate oxea, Centrotylote oxea, Fusiform oxea) dan mikrosklera tetraxon spikula Oxyaster.
Kata Kunci : Antibakteri, Spons, Difusi agar, Identifikasi Spons
